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WB实验操作流程及注意事项

WesternBlot（蛋白质印迹法）作为分子生物学研究中常用的蛋白质检测技术，其原理是基于抗原抗体特异性结合，通过凝胶电泳分离蛋白质样品，随后将其转移到固相载体上，再利用特异性抗体进行检测。这项技术的核心在于精确的操作和对细节的把控，任何一个环节的疏漏都可能导致实验结果的偏差甚至失败。本文将结合实践经验，详细阐述WB实验的标准操作流程及各环节的关键注意事项，以期为科研工作者提供实用参考。

一、实验前准备

实验前的充分准备是确保WB实验顺利进行的基础，这不仅包括试剂耗材的准备，更涵盖了实验设计的合理性考量。

（一）实验设计与样本规划

在动手操作之前，清晰的实验设计至关重要。需明确实验目的，确定待检测的目标蛋白，以及所需的生物学重复和技术重复数量。样本的收集与处理应遵循规范，确保蛋白的完整性。例如，对于动物组织样本，应尽可能在取材后迅速置于液氮中速冻，然后转移至超低温冰箱保存；细胞样本则需用适当的裂解液冰上裂解，避免反复冻融导致蛋白降解。同时，要预估样本数量和所需试剂用量，避免实验中途因试剂不足而中断。

（二）试剂与耗材的准备及检查

1.主要试剂：

*丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺：确保试剂在有效期内，粉末状试剂应保持干燥，避免吸潮。配置好的储存液需避光保存于4℃，并注意观察是否有沉淀产生，如有沉淀应重新配制。

*SDS、Tris、HCl、NaCl等缓冲液成分：均需使用分析纯试剂，按实验要求精确称量，用超纯水溶解。缓冲液配制完成后，需用pH计校准至所需pH值，必要时进行过滤除菌或高压灭菌（根据缓冲液性质而定），标记清楚名称、pH值和配制日期。

*上样缓冲液：含有SDS、β-巯基乙醇（或DTT）和溴酚蓝等成分，使用前需确认是否已添加还原剂，若长期放置，β-巯基乙醇易挥发，需适当补加。

*电泳缓冲液与转膜缓冲液：根据实验需求选择合适的配方，如Tris-甘氨酸系统或Tris-硼酸系统。转膜缓冲液中通常需加入甲醇，甲醇具有挥发性且对人体有害，操作时需在通风橱内进行，且现用现配效果更佳。

*封闭液：常用的有脱脂奶粉溶液和BSA溶液。脱脂奶粉成本较低，但可能含有磷酸酶或某些蛋白的干扰，BSA则更为纯净，但价格较高。需根据一抗特性和实验要求选择，并注意现配现用，避免污染。

*抗体：一抗和二抗是WB实验的核心试剂。需根据目标蛋白的种属、亚型选择特异性强、效价高的抗体。抗体储存于-20℃，避免反复冻融，建议分装保存。使用前需根据说明书进行适当稀释，稀释液通常为含少量封闭剂和防腐剂的PBST或TBST。

*显色/发光试剂：根据检测方法选择对应的底物，如HRP标记抗体对应化学发光底物，AP标记抗体对应显色底物。化学发光底物需注意避光保存，且不同品牌的底物灵敏度和发光时间有所差异。

2.主要耗材：

*电泳槽及转膜槽：使用前需检查槽体是否完好，电极是否清洁，密封圈是否老化，确保电泳和转膜过程中无漏液现象。

*凝胶玻璃板：需保持洁净、无划痕，使用前可用无水乙醇擦拭去除油污。

*梳子：选择合适齿数和厚度的梳子，梳子齿应平整光滑，避免产生气泡或影响加样。

*PVDF膜或硝酸纤维素膜（NC膜）：PVDF膜结合能力强，机械强度高，需用甲醇预处理；NC膜对小分子量蛋白结合较好，无需预处理，但脆性较大。根据目标蛋白特性和实验需求选择，并注意区分膜的正反面。

*滤纸、海绵垫：转膜时使用，需裁剪至与凝胶和膜大小匹配，质地均匀，无杂质。

*移液器及吸头：确保移液器校准准确，吸头为无酶、无热源的一次性吸头，避免交叉污染。

*离心管、EP管：用于试剂配制、样本处理和储存，需保持洁净。

（三）实验环境与安全

实验台面需保持整洁，操作前用75%乙醇擦拭消毒。实验过程中涉及多种化学试剂，如丙烯酰胺（神经毒）、甲醇、β-巯基乙醇（刺激性气味）等，务必在通风橱内操作，并佩戴手套、实验服、护目镜等个人防护用品。废弃试剂和耗材需按实验室规定分类处理。

二、核心操作流程

（一）蛋白质样品制备与定量

蛋白质样品的质量直接决定WB实验的成败。

1.样品裂解：根据样本类型（细胞、组织、细菌等）选择合适的裂解液。裂解液中通常含有去污剂（如SDS、TritonX-100）、蛋白酶抑制剂（如PMSF、蛋白酶抑制剂cocktail）和磷酸酶抑制剂（如需检测磷酸化蛋白）。裂解过程应在冰上进行，充分裂解组织或细胞，以释放目标蛋白。对于组织样本，需先进行剪碎、匀浆等处理。

2.离心澄清：裂解后的样品需在低温（4℃）下离心，离心力和时间需根据样本类型和裂解液特性调整，目的是去除细胞碎片、细胞核等不溶物，取上清液即为总蛋白提取物。离心后应避免反复吹打上清，以防再次混入沉淀。

3.蛋白定量