质粒基因重组实验.pdfVIP

基因工程制药技术

实验五：质粒载体和目的基因的体外重组

实验原理：

由于选择的限制性核酸内切酶的不同，会产生黏性末端和平滑末端两种，所以DNA

重组的方法主要有黏端连接法和平端连接法。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用

2+

下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进

行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使黏性末端的DNA分

子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比黏性末

端的连接效率低，一般可通过提高T4DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端

的连接效率。


如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）

处理，去掉酶切后5端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，

提高重组子的筛出效率。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，黏性末端

的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12～16℃，反应12~16h（过夜），这样既

可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到黏性末端短暂配对结构的稳定。


实验仪器：离心机、恒温金属浴、微量移液器等。

实验材料：酶切回收的目的基因、质粒载体、酶切试剂盒（TaKaRa）；

实验方法：

1、连接反应液的制备：取1支干净的灭菌的Eppendorf管，分别按以下加入：1.5uL

质粒载体DNA溶液、2.5uL目的DNA溶液、5uLSolutionⅠ。总体积为10uL。涡旋后混

合均匀，旋至无气泡。需要注意的是SolutionⅠ因含有T4DNA连接酶，使用前应在冰

中融化并轻柔混匀。

2、将混合液16℃反应30分钟。