重组质粒电泳鉴定.pdf

基因工程制药技术

实验七：重组克隆的电泳鉴定

实验原理：

重组的质粒DNA分子经过抗生素和蓝白斑的初筛后，可以根据质粒的大小来确定它

是否带有插入片段。机挑取若干个转化子，提取质粒，与空载体对照同时进行琼脂糖凝

胶电泳，当空载体质粒有目的基因插入后，其迁移速率与空载体质粒相比会变慢，根据

琼脂糖凝胶条带的相对位置和大小，来鉴定重组子。

实验器材：微量移液器、台式高速离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统等。

实验材料：待鉴定的重组子、碱裂解法提取质粒所需的溶液、去离子水、凝胶加样

缓冲液、琼脂糖、GelRed、DNA相对分子质量标准物等。

实验方法：

1.使转化得到的细菌在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上生长至菌落直径达1mm

左右。

2.用灭菌的枪头随机挑取12个单菌落，分别接种于含氨苄青霉素的LB液体培养

基，37℃培养过夜。

3.每管分别取出100μL菌液，编好序号，保存于4℃，直至筛选出阳性克隆。

4.将剩下的菌液参考碱裂解法提取质粒，最后分别用30μ去离子水溶解质粒。

5.制备0.8%的琼脂糖凝胶，将5μL提取的质粒溶液进行琼脂糖凝胶电泳。

6.紫外灯下观察，拍照，观察各泳道质粒的迁移率和大小。

注意：

在提取质粒前必须将各菌液取一小部分保种，且在实验的整个过程中注意各菌液序

号不能混淆。此外电泳时必须与DNA相对分子质量参照物同时电泳，最好设立1个空载

体对照，有助于重组子的鉴定。该法只是初步筛选鉴定，还需要进一步做做酶切鉴定、

PCR鉴定以及序列分析等。