重组子筛选方法.pdf

基因工程制药技术

重组子的筛选

P1:这节课我们来学习重组子的筛选和鉴定。由体外重组产生的DNA分子，通过转

化、转染、转导等适当途径引入宿主会得到大量的重组体细胞或噬菌体。面对这些大量

的克隆群体，需要采用特殊的方法才能筛选出可能含有目的基因的重组体克隆。同时也

需要用某种方法检测从这些克隆中提取的质粒或噬菌体DNA，看其是否确实具有一个插

人的外源DNA片段。即便在这一问题得到了证实之后，也还不能肯定这些重组载体所含

有的外源DNA片段就一定是编码所研究的目的基因的序列。为解决这一系列的问题，从

为数众多的转化子克隆中分离出含有目的基因的重组体克隆，需要建立一整套行之有效

的特殊方法。

目前已经发展和应用了一系列构思巧妙、可靠性较高的重组体克隆检测法，

包括使用特异性探针的核酸杂交法、免疫化学法、遗传检测法和物理检测法等。

P2：遗传检测法可分为根据载体表型特征和根据插入序列的表型特征选择重组子。

这节课我们来学习载体标记筛选法，基因工程中使用的所有的载体分子，都带有一个可

选择的遗传标记或表型特征。质粒以及柯斯载体具有抗药性标记或营养标记，而对于噬

菌体来说，噬菌斑的形成则是它们的自我选择特征。根据载体分子所提供的遗传特征进

行选择，是获得重组体DNA分子群体的必不可少的条件之一。正如已经叙述过的，这种

遗传选择法能将重组体的DNA分子同非重组体的亲本载体分子区别开来。抗药性标记的

插入失活作用，或者是诸如β–半乳糖苷酶基因一类的显色反应，便是属于这种依据载

体编码的遗传特性选择重组体分子的典型方法。

P3：根据载体的抗药性标记进行筛选，主要是依据载体上存在一些抗药基因，如抗

氨苄青霉素基因、抗四环素基因、抗卡那霉素基因等，凡是转入了载体的细胞都获得

了这种

抗药性，可以在平板上生长菌落。

P4：即当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获

得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能

生长。经过抗药性筛选获得的大量转化子中既包含所需要的重组子，也包含非重组子即

空载体，因此利用载体的抗药性标记进行筛选并不能完全筛选出所需要的重组子，这就

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出现了第二种载体标记筛选法即插入失活选择法。

P5：插入失活是指将外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中，而使此基因失活，

丧失其原有的表型特征，标记基因多为抗生素抗性基因。例如pBR322质粒上有氨苄青

霉素和四环素两个抗药基因，在四环素抗药基因上有BamHI和SalI限制性酶切位点，

氨苄青霉素抗药基因上有PstI的酶切位点。

P6：其筛选的过程主要是将外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失

活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落。如四环素抗性

插入失活，在四环素抗性基因上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素

平板培养基选择重组克隆。

P7：让细菌在含有氨苄青霉素或四环素的培养基中增值，凡是未接受质粒DNA的细

胞都不能生长；凡是在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能生长的细菌是含有质粒

PBR322的，但质粒上未插入目的序列；凡在氨苄青霉素的培养基中能生长，而在四环

素的培养基中不能生长的细菌就很有可能是含有目的序列的重组质粒。

P8：同理，如果在抗氨苄青霉素的基因上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因

失活，可用碘-青霉素指示液选择。

P9：利用双抗菌素抗性选择标记进行重组子的筛选，通过抗菌素基因的插入失活，

分两次先后选择，即没有获得载体的寄主细胞，在在Amp或Tet中都死亡；获得重组载

体的寄主细胞，在Amp或Tet其中之一中死亡。

P10：显色反应选择法是指根据在指示培养基上的颜色直接筛选重组克隆的方法，

比如应用最为广泛的-半乳糖苷酶显色法，又叫蓝白斑筛选法。

P11：蓝白斑筛选法的原理是基于α互补原理，主要适用于含有β-半乳糖苷酶

基因（LacZ）的载体，如PUC系列的载体等，其基本原理是该载体上有一段β-半乳

糖苷酶基因（LacZ）的α片段（氨基端），其上有外源DNA的插入