种子SOD酶活性测定实验.docx

实验实训三种子超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性的测定

Ⅰ超氧化物歧化酶活性测定

一、目的要求

掌握种子超氧化物歧化酶活性的测定方法。

二、实验原理

超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）是需氧生物中普遍存在的一种含金属辅基的酶，是一种清除超氧阴离子自由基（·O2-）的酶。核黄素可被光还原，在有氧条件下极易再氧化而产生，当加入氯化硝基氮蓝四唑（NBT）后，在光照下被还原为蓝色化合物，产物在560nm处有最大吸收峰，而SOD作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。于是光还原反应后，反应液颜色越浅，说明酶活性越高，反之，酶活性越低。通过测定反应液的吸光值，可计算出SOD的活性。

三、实验材料与设备

1.材料：水稻、大豆吸胀种子。

2.设备：高速冷冻离心机、分光光度计、荧光灯（反应试管处光照度为4000lx）或光照培养箱（照度为4000lx），玻璃质地和规格一致的试管、旋转的圆盘透明试管架（有机玻璃制造）、黑色硬纸套、研钵、酸度计、天平（感量0.001g、0.0001g）等。

3.试剂：

（1）50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）

A液（0.2mol/L磷酸二氢钠）：3.12gNaH2PO4·2H2O，以蒸馏水溶解，并定容至100mL。

B液（0.2mol/L磷酸氢二钠）：71.7gNa2HPO4·12H2O，以蒸馏水溶解，并定容至1000mL。

先分别配制A液和B液，再取21.25mLA液与228.75mLB液混合，稀释至1000mL。于4℃冰箱保存。

（2）酶提取液

提取液A：50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8），含1％（m/V）聚乙烯吡喏烷酮（PVP）。

提取液B：50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8），含0.1mmol/LEDTA、0.3％（m/V）曲拉通（TritonX-100）和4％（m/V）PVP。

（3）130mmol/LL-蛋氨酸（L-Met）溶液准确称取1.9397gL-Met（相对分子量为149.21），用磷酸缓冲液（pH7.8）溶解并定容至100mL，溶液需现配现用。

（4）750μmol/L氯化硝基四氮唑蓝（NBT）准确称取0.1533gNBT（相对分子质量为817.60），用磷酸缓冲液（pH7.8）溶解并定容至250mL，现配现用，避光保存。

（5）100μmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）准确称取0.03722gEDTA-Na2（相对分子质量为372.24），用磷酸缓冲液（pH7.8）溶解并定容至1000mL。

（6）20μmol/L核黄素（又称维生素B2）准确称取0.0075g核黄素（相对分子质量为376.36），用磷酸缓冲液（pH7.8）溶解定容至1000mL，避光保存，随用随配，用时稀释10倍。

四、方法步骤

1.酶液制备

方法A：称取1.0g吸胀种子，加入5mL提取液A，在冰上研磨后，于4℃以12000r/min离心20min，上清液即为酶粗提取液。

方法B：取1.0g吸胀种子，用液氮研磨成粉，然后加入5倍于样品量的酶提取液B在冰浴上研磨成匀浆，将匀浆在4℃下以12000r/min离心20min。上清液为SOD酶粗提取液。

2.酶活性的测定

取透明度好、质地相同的试管4支，2支为测定管，2支为对照管，按表9-1加入试剂，以不加酶液的作为对照，混匀后，给一支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套避光，与其他各管同时置于光照培养箱内反应10～20min（要求各管照光情况一致，反应温度控制在25℃，视酶活性高低适当调整酶的浓度和反应时间）。

反应结束后，用黑布罩上试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，用分光光度计在560nm波长下测定各管的吸光值。

表9-1SOD反应混合液配制表

试剂

用量（mL）

终浓度（比色时）

磷酸缓冲液（pH7.8）

1.5

甲硫氨酸（Met）溶液

0.3

13mmol/L

NBT溶液

0.3

75μmol/L

EDTA-Na2

0.3

10μmol/L

核黄素溶液

0.3

2.0μmol/L

酶液

0.1

2支对照管以缓冲液代替

水

0.5

总体积

3.3

注：当测定样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶液和核黄素除外）按比例混合后一次加入2.90mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变，其余各步与上相同。

3.SOD活性计算SOD活性以抑制NBT光还原反应50％的酶量为一个酶活性单位（U）。按下式计算SOD活性。

式中，SOD总活性A以酶活性单位每克鲜样表示（U/g），A0为对照管的吸光值；As为样品管的吸光值；VT为酶提取液的总体积，mL；Vn为测