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2023年酵母RNA的提取及组分鉴定实验报告

一、实验目的

掌握稀碱法提取酵母RNA的基本原理和操作流程，理解细胞破碎、核酸分离与沉淀的核心机制。

学习使用紫外分光光度计测定RNA浓度与纯度的方法，掌握血球计数板计数酵母细胞的技能。

通过化学试剂反应鉴定RNA的核心组分（核糖、磷酸、嘌呤碱），验证核酸的化学组成特性。

分析实验过程中的关键影响因素，提升实验操作的规范性和问题解决能力。

二、实验原理

（一）RNA提取原理

酵母细胞中RNA含量高达4.67%-10.0%，而DNA仅为0.03%-0.516%，是提取RNA的理想材料。稀碱法利用1%NaOH溶液（本实验采用0.04mol/LNaOH）溶解酵母细胞壁，释放胞内RNA；通过酸中和调节pH值，同时沸水浴使蛋白质变性，实现核酸与蛋白质的分离。RNA的等电点为pH2.5，向溶液中加入酸性乙醇可中和碱性环境，使RNA因溶解度降低而沉淀析出，再经95%乙醇洗涤去除杂质，获得RNA粗品。该方法操作简便、耗时短，但需注意碱性条件可能导致RNA部分降解，需严格控制反应时间。

（二）定量与鉴定原理

RNA定量：核酸因含共轭双键系统，在260nm波长处有特征紫外吸收峰，每毫升含1μgRNA的溶液吸光值为0.022，通过测定OD???值可计算浓度；纯RNA的OD???/OD???比值应在1.8-2.2之间，用于判断纯度。

组分鉴定：

核糖：RNA水解后产生的核糖与地衣酚试剂在Fe3?催化下，沸水浴生成鲜绿色复合物。

磷酸：水解液中的磷酸与定磷试剂（硫酸、钼酸铵、抗坏血酸混合液）反应生成蓝色钼蓝。

嘌呤碱：嘌呤碱与硝酸银在碱性条件下生成白色嘌呤银化合物沉淀。

（三）酵母计数原理

血球计数板的大方格容积为0.1mm3（万分之一毫升），内含400个小方格，通过计数中方格内酵母细胞数，可换算出每毫升菌液的细胞总数。

三、实验材料与仪器

（一）材料与试剂

材料：干酵母粉（分析纯）、石英砂（研磨辅助）。

试剂：0.04mol/LNaOH溶液、酸性乙醇（0.3mL浓盐酸+30mL95%乙醇）、95%乙醇、1.5mol/L硫酸、浓氨水、0.1mol/L硝酸银溶液；定磷试剂（17%硫酸：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸：水=1:1:1:2，临用前混合）；地衣酚乙醇溶液、三氯化铁浓盐酸溶液。

（二）仪器设备

分析天平、研钵、250mL三角瓶、离心管、离心机（转速≥3000r/min）、恒温水浴锅、冰浴装置、紫外分光光度计、血球计数板、盖玻片、显微镜、移液管、试管架等。

四、实验步骤

（一）酵母细胞计数

取少量干酵母，用无菌水制备菌悬液，稀释至适宜浓度（每中方格含5-10个细胞）。

血球计数板加盖盖玻片，沿边缘滴加菌悬液，静置5min后显微镜观察，计数25个中方格内的细胞总数（压线细胞计上不计下、计左不计右）。

计算：每毫升细胞数=（25个中方格细胞总数/25）×400×10?×稀释倍数。

（二）稀碱法提取RNA

称取10g干酵母粉置于研钵中，加入少许石英砂和50mL0.04mol/LNaOH溶液，充分研磨5min至浆状。

将酵母浆转入100mL三角瓶，沸水浴加热30min，冷却至室温后，3000r/min离心15min，收集上清液（含RNA）。

边搅拌边将上清液缓慢倒入20mL酸性乙醇中，静置5min使RNA充分沉淀，3000r/min离心10min，弃上清液。

向沉淀中加入10mL95%乙醇，振荡洗涤后3000r/min离心5min，重复洗涤1次，去除残留杂质。

将沉淀转入布氏漏斗抽滤，获得湿RNA粗品，用分析天平称重。

（三）RNA组分鉴定

取2gRNA粗品，加入10mL1.5mol/L硫酸，沸水浴加热10min制备水解液（确保RNA完全降解）。

嘌呤碱鉴定：取1mL水解液，加入过量浓氨水调节pH至碱性，再加入1mL0.1mol/L硝酸银溶液，观察是否产生白色沉淀。

核糖鉴定：取1mL水解液，加入2mL三氯化铁浓盐酸溶液和0.2mL地衣酚乙醇溶液，沸水浴3-5min，观察溶液颜色变化。

磷酸鉴定：取1mL水解液，加入1mL定磷试剂，沸水浴加热，观察是否出现蓝色。

（四）RNA定量与纯度检测

取少量RNA沉淀，用适量无RNA酶水溶解，制备待测液。

紫外分光光度计分别测定OD???和OD???值，计算RNA浓度（浓度=OD???×稀释倍数×45.45μg/mL，推导：1/0.022≈45.45）和OD???