罗氏荧光定量PCR.pptVIP

FluorescenceCycles参考序列FluorescenceCycles目标序列未知样本结果=目标基因浓度内参基因浓度CyclesFluorescence标准曲线标准曲线CyclesFluorescenceCrossingPointLogConcentrationCrossingPointLogConcentration相对定量

用外标法进行相对定量目的基因X管家基因H分析结果已知量Ct定量结果已知量Ct定量结果标准品1135.66137.46-标准品21032.771033.06-标准品310029.2010029.69-标准品4100025.75100026.10-标准品51000022.061000022.51-标准品610000018.6210000018.88-Sample1-27.22343.3-23.176391.50.0537Sample2-31.7017.3-22.708589.70.0020Sample3-24.621946.1-22.937432.90.2618相对定量

用外标法进行相对定量实时定量PCR定量原理绝对定量相对定量外部标准曲线(单色)外部标准曲线

(无校准样本)校准样本归一化方法无效率矫正有效率矫正外部标准曲线带内对照(双色)定量分析原理相对定量

原理(2)用校正样本对最终结果进行归一化处理。这为不同批次的实验提供了一个稳定的校正点，从而使实验人员能够对不同时间、不同批次的多次实验结果差异进行校正。校正样本用于对最终结果进行归一化处理的样本。校正样本的目标基因和内参基因均需为阳性，且其目标基因与内参基因的浓度比必须稳定不变。校正样本提供了一个不同PCR实验结果间的比较（作为阳性对照）。校正样本能够对目标基因和内参基因间的检测灵敏度差异进行校正。它不能够对目标基因和内参基因直接的PCR效率差异进行校正。待测基因浓度内参基因浓度（未知样本）校正样本归一化处理的相对浓度＝待测基因浓度内参基因浓度（校正样本）利用校正样本进行归一化处理

为不同批次的PCR反应提供恒定的校正点目标基因及内参基因不同批次的检测灵敏度不一是由于:探针复性的差异染料淬灭系数的差异荧光共振能量传递效应（FRET）的效率差异利用校正样本进行归一化处理可以对这些差异做校正利用校正样本进行归一化处理为不同批次的PCR反应提供恒定的校正点具体方法为:用每个样本目标基因与内参基因的比值，除以同一个校正样本目标基因与内参基因的比值校正样品的选择用于对最终结果进行归一化处理的样本

每个样本目标基因与内参基因的比值，除以同一个校正样本目标基因与内参基因的比值校正样本能够对多次实验中目标基因和内参基因间的检测灵敏度差异进行校正(e.g.,long-termstudies)

通常是一个典型的阳性样本(目标基因和内参基因均为阳性)未处理的细胞系或样本起始时间点的样本正常组织样本…不能够对目标基因和内参基因直接的PCR效率差异进行校正

建立目标基因及参考基因的PCR反应体系

以便进行相对定量建立反应体系：目标基因与参考基因分别位于不同孔内。以便检测表达水平的较大差异目标基因与参考基因不同批次扩增可使用不同PCR程序目标基因与参考基因可使用不同检测模式(如分别用SYBRGreenI和HybProbe模式)目标基因与参考基因进行多重PCR（双色）两种序列的竞争会降低检测的线性范围针对不同的参考基因浓度检测梯度稀释的目标基因，以检查线性范围利用校正样本进行归一化处理

两种处理方法相对定量(以校正样本归一化处理)精确值

=带扩增效率校正

-method近似值

=没有扩增效率校正

ΔΔCT法全部假设:E=2相对定量计算公式=2-ΔΔCT相对定量计算公式=

ETCpT(C)-CpT(S)XERCpR(S)-CpR(C)校正目标基因和内参基因实际上不同的扩增效率相对定量方法(1)

??CT法

该方法假设：目标基因和内参基因的PCR扩增效率相同扩增过程在整个PCR反应中保持恒定不变(E=2)

归一化的相对比率=2-ΔΔCT

无需标准曲线Gene118SNormalized