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乳制品中β-乳球蛋白双抗夹心与间接竞争ELISA检测方法的构建与效能比对

一、引言

1.1研究背景与意义

近年来，随着人们生活水平的提高，对食品质量和安全的关注度日益增加。食物过敏作为一种常见的食品安全问题，给消费者的健康带来了严重威胁。据统计，全球约有2-6%的儿童和1-3%的成年人受到食物过敏的影响，且其发病率呈逐年上升趋势。牛乳作为一种重要的营养来源，富含蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养成分，被广泛应用于食品工业中。然而，牛乳也是常见的食物过敏原之一，约有2-7.5%的婴幼儿对牛乳过敏，严重影响了婴幼儿的生长发育和身体健康。

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）是牛乳中的主要过敏原之一，占牛乳总蛋白的8%-10%，占乳清蛋白的50%左右。它是一种小分子球状蛋白质，由162个氨基酸残基组成，分子量约为18.4kDa，等电点为5.1-5.3。β-Lg具有较强的致敏性，能够引起人体免疫系统的异常反应，导致皮肤、呼吸道、消化道等多个系统的过敏症状，如皮疹、瘙痒、呼吸困难、呕吐、腹泻等。严重的牛乳过敏反应甚至可能危及生命。因此，建立快速、准确、灵敏的β-Lg检测方法，对于预防和控制牛乳过敏，保障消费者的健康具有重要意义。

在乳业生产中，β-Lg的含量也是衡量乳制品质量和安全性的重要指标之一。通过检测β-Lg的含量，可以评估乳制品的加工工艺和质量稳定性，确保产品符合相关标准和法规要求。此外，对于一些特殊人群，如牛乳过敏患者、素食者等，准确标识乳制品中β-Lg的含量，有助于他们选择合适的食品，避免过敏风险。因此，建立高效的β-Lg检测方法对于乳业的发展和食品安全监管也具有重要的推动作用。

1.2β-乳球蛋白概述

β-Lg主要存在于反刍动物（如牛、羊）的乳汁中，在牛乳乳清中占蛋白质总量的43.6%-50.0%，在脱脂牛乳中的含量约为2.0-4.0g/L。它是一种由乳腺上皮细胞合成的乳特有蛋白，其分子为一条多肽链，由162个氨基酸残基组成，主要以稳定的二聚体形式存在，由非共价键连接的两个单体组成。每个单体含有5个半胱氨酸残基，其中4个残基在链内形成2个二硫键（Cys66-Cys160和Cys106-Cys199），还有一个Cys121为游离巯基。

β-Lg的三维结构在中性pH值时是由8条反平行链组成的β桶状结构，有1个α+1拓扑，桶外存在着一个具有3个转角的α螺旋和第9条β链。在生理状态下，β-Lg的二聚体像一个拉长的椭圆体，长约6.95nm，宽约3.6nm。通过旋光色散和圆二色性技术研究发现，β-Lg的二级结构包括10%-15%的α-螺旋、43%的β-折叠和47%的无序结构。

β-Lg的结构和性质会随着溶液酸碱度的变化而显著改变。在pH3.5-5.5或pH8.0时，β-Lg二聚体解离成单体。这种结构的变化可能会影响其致敏性和其他生物学功能。

对于新生的小牛而言，β-Lg发挥着类似于免疫球蛋白的功能。然而，对于未满一岁的婴儿来说，由于他们的消化系统尚未充分发育，β-Lg更容易被整个吸收进入体内，从而被免疫系统误判为外来病原体，引发过敏反应。这是因为婴儿的肠道屏障功能不完善，对蛋白质的消化和吸收能力较弱，无法有效降解β-Lg，使其以完整的形式进入血液循环，刺激免疫系统产生特异性抗体（如IgE）。当再次接触β-Lg时，IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的FcεRI受体结合，引发一系列的过敏反应。

1.3酶联免疫检测技术简介

酶联免疫吸附测定法（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）是一种常用的免疫学检测技术，其基本原理是基于抗原抗体的特异性结合反应，利用酶标记物的催化作用，将底物转化为有色产物，通过测定有色产物的吸光度来间接检测样本中抗原或抗体的含量。

ELISA常用的检测模式包括直接ELISA、间接ELISA、双抗体夹心ELISA和竞争ELISA等。直接ELISA用于检测抗体，抗原直接固定在固相表面，直接与酶标记的抗体反应。间接ELISA也用于检测抗体，抗原固定在固相表面，首先与待测样本中的抗体反应，然后加入酶标记的二抗。双抗体夹心ELISA用于检测抗原，使用捕获抗体固定抗原在固相表面，然后加入检测抗体，最后使用酶标记的二抗。竞争ELISA用于检测抗原，样本中的抗原与固相表面的抗原竞争结合酶标记的抗体。

ELISA在食品检测领域具有广泛的应用，其优势主要体现