代森锰锌对抗生素耐药质粒接合转移的影响及其调控机制.pdfVIP

第四章代森锰锌暴露下接合转移体系转录组分析51

4.1引言51

4.2材料与方法51

4.2.1药品与试剂51

4.2.2仪器与设备52

4.2.3接合菌液样品收集与准备52

4.2.4文库构建与转录组测序52

4.2.5转录组数据质控52

4.2.6参考基因组比对53

4.2.7基因表达定量分析53

4.2.8基因差异表达分析与富集分析53

4.3结果与分析53

4.3.1转录组数据统计与质量评估53

4.3.2参考基因组比对结果54

4.3.3转录组测序相关性和主成分分析55

4.3.4代森锰锌胁迫下质粒RP4接合转移相关基因表达水平的倍数变化55

4.3.5代森锰锌胁迫下供受体菌重要功能基因表达水平的倍数变化57

4.3.6供受体细菌基因差异表达分析与富集分析59

4.4小结64

第五章结论与展望65

5.1主要结论65

5.2主要创新点67

5.3研究不足与展望67

参考文献68

攻读硕士学位期间研究成果82

致谢83

摘要

设施农业环境中农药残留和抗生素抗性基因（Antibioticresistancegenes,ARGs）

复合污染问题日益突出，对生态环境和人体健康构成潜在威胁。已有研究发现消毒

剂、纳米材料、重金属等非抗生素类环境污染物能通过促进水平基因转移作用提高

环境中ARGs的丰度，但农药胁迫下ARGs的传播规律及调控机制尚不清楚。本

文选择含重金属的常用农药代森锰锌为目标化合物，构建合适、稳定的细菌耐药质

粒同属和跨属接合转移体系，采用选择性标记的传统平板培养法研究代森锰锌胁

迫下多重耐药质粒RP4接合转移频率变化规律，并通过透射电子显微镜、流式细

胞仪和实时荧光定量PCR等技术研究细菌细胞内活性氧（ROS）水平、细胞膜通

透性、相关调控基因mRNA表达水平的变化。同时，采用转录组测序技术（RNA-

seq）测定跨属接合转移体系中供受体菌转录表达情况，分析代森锰锌胁迫下接合

转移体系中关键调控基因表达水平的变化。研究结果为揭示农药污染环境中ARGs

的水平传播机制提供科学依据，也为全面评价代森锰锌污染生态风险提供新的认

识。主要研究结果如下：

（1）以携带RP4质粒的EscherichiacoliMG1655（E.coliMG1655）为供体菌，

E.coliHB101和PseudomonasputidaKT2440（P.putidaKT2440）为受体菌分别构

建了同属和跨属接合转移体系。耐药质粒RP4的接合转移频率随着代森锰锌暴露

浓度（0~10mg/L）的增加呈现先上升再下降的变化趋势，其中，1mg/L代森锰锌

暴露下耐药质粒RP4的同属和跨属接合转移频率分别达到最大值（2.40×10-4和

9.31×10-5），是空白对照组的5.55倍和8.97倍，10mg/L代森锰锌暴露下使细菌产

生严重损伤导致供受体菌浓度过低，从而接合转移频率下降。此外，接合转移过程

中（0~8h）代森锰锌主要是以母体形式存在而不是代谢物或者所含重金属（Mn和

Zn离子），表明代森锰锌母体在促进质粒RP4接合转移中起主要作用。

（2）代森锰锌（0~10mg/L）暴露下细菌E.coliMG1655、E.coliHB101和P.

putidaKT2440胞内ROS水平分别是空白对照组的1.35~2.12倍、1.08~1.74倍和

1.34~11.92倍。添加活性氧清除剂硫脲后，0.01~1mg/L代森锰锌胁迫下质粒RP4

接合转移频率较未添加时均显著下降（p0.05），表明供受体菌胞内ROS水平的

上升是代森锰锌促进RP4质粒接合转移频率升高的重要机制之一。通过透射电子

显微镜观察发现1mg/L代森锰锌暴露下供受体菌细胞膜受到一定程度损伤。此外，

通过流式细胞仪发现代森锰锌（0~10mg/L