Rpn+和+Rac+及脂质识别蛋白+ML+对褐飞+虱发育、生殖的影响.pdfVIP

弟、陶帅师弟总能任劳任怨地听我“使唤”，感谢你们在我实验中的无私帮助！此外，我还

要感谢C1018里张厚洪、罗序梅、陈孙杰、陈好好、谢雨澄、张小雅、王欣秋、刘奕来、

李晗婧、李泽栋、张璐、戴珍玮等师弟师妹的帮助。

感谢我的研究生室友高庆、刘超，永远怀念那一个个一起探讨科研，一起聊人生规划，

一起在召唤师峡谷战斗的夜晚。我也要感谢我的几位挚友：李倩、郭根源、邹茹冰，谢谢

你们对我的关心与照顾！

感谢浙江大学公共测试平台吴筱丹老师、农生环电镜中心谢礼老师、王伟兰老师对我

实验中帮助。感谢浙江大学核农所戴镜郦博士在本论文蛋白空间结构解析部分给予的帮助。

非常感谢我的家人，是你们用无私的爱支持着我走到了现在，你们永远是我最坚强的

后盾，最温暖的港湾。

最后，我要感谢参与本次博士学位论文评审、答辩专家，感谢你们提出的宝贵建议，

使我的论文更加完善，谢谢！

王威

2021年11月于浙江大学紫金港

摘要

26S蛋白酶体是真核细胞重要的蛋白水解分子机器，承担着80%以上蛋白的水解功能，

因此它与细胞内众多的生命活动密切相关，如：细胞周期调控、细胞代谢、免疫应答、转

录调控、信号转导和DNA修复等。26S蛋白酶体由33个不同的蛋白亚基组成，分子量大

小约为2.5MDa，是迄今为止发现的最复杂的蛋白酶复合体。目前关于26S蛋白酶体的研

究主要集中于结构生物学、生物化学以及生物信息学方面的研究，而昆虫中26S蛋白酶体

亚基在体内的生理功能尚未有系统性研究报道。褐飞虱（Nilaparvatalugens）属于半翅目

飞虱科，是我国及其它亚洲国家重要的水稻害虫。由于褐飞虱具有系统性RNA干扰（RNAi）

效果，近年来已成为研究基因功能的新的模式昆虫。本研究在褐飞虱中鉴定了14个蛋白

酶体亚基，包括11个非ATP酶调节亚基（NlRpn）及3个蛋白酶组装分子伴侣（NlRac），

同时利用转录组学测序分析筛选获得了一个表达受蛋白酶水解活性调控的脂质识别相关

蛋白基因NlML1。利用RNAi、免疫组化、透射电镜（TEM）及联合组学分析等方法，探

究了褐飞虱NlRpn/NlRac及NlML1基因在生殖发育、脂质代谢等过程中的生理功能。本研

究取得的结果如下：

1.鉴定了14条NlRpn和NlRac基因序列。本研究在褐飞虱中共鉴定到11个NlRpn和

3个NlRac基因序列，qRT-PCR实验显示14个NlRpn和NlRac基因在雌成虫或卵期高表

达，且在雌虫卵巢高表达。氨基酸序列分析表明14个NlRpn和NlRac蛋白具有不同的保

守功能域；系统进化分析显示NlRpn及NlRac在不同昆虫的同源蛋白高度保守。

2.蛋白酶水解活性对褐飞虱雌成虫生殖至关重要。本研究表明沉默NlRpn及NlRac基

因表达显著降低蛋白酶体水解活性，进而抑制多个脂质代谢酶、卵黄原蛋白（Vg）和20-

羟基蜕皮激素（20E）合成酶等关键基因的表达，导致褐飞虱雌成虫Vg、20E含量显著降

低及卵巢中脂质代谢异常，最终造成卵巢发育受阻、发育致死等异常表型。

3.鉴定了褐飞虱ML基因家族，通过RNAi探究了NlML1基因功能。明确了褐飞虱

具有三个NlML蛋白，其空间结构、进化关系和时空表达模式差异明显。免疫组化分析揭

示了NlML1蛋白在褐飞虱脂肪体细胞膜、滤泡细胞膜及囊胚层细胞膜分布。通过RNAi实

验发现沉默NlML1显著抑制褐飞虱若虫发育及雌虫生殖。

4.NlML1通过影响20E的含量进而影响褐飞虱生殖、发育。通过转录组学+代谢组学

联合分析和qRT-PCR验证，明确了NlML1介导的脂质代谢通路网络。该网络由6条关键

脂质代谢通路组成，富集了34个脂质识别、代谢和转运相关基因及56个脂质代谢物。通

过分析该通路网络，本研究发现沉默NlML1会抑制多个胆固醇相关转运基因、脂质代谢

基因、表皮相关基因表达，进而造成20E含量显著降低、脂质代谢异常、表皮形成受阻，

最终使褐飞虱产生蜕皮困难、发育停滞、生殖异常等缺陷表型。而回补20E在不改变NlML1

表达的情况下，可以挽救褐