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颠茄TRI基因的分子解析及其对托品烷生物碱合成的调控机制研究

一、引言

1.1研究背景与目的

颠茄（AtropabelladonnaL.）作为茄科颠茄属的多年生草本植物，是我国药典规定的托品烷类生物碱（TropaneAlkaloids，TAs）来源的唯一药用植物，也是商业上莨菪碱、东莨菪碱的最主要药源。在临床上，莨菪碱和东莨菪碱作为应用广泛的抗胆碱类药物，发挥着重要的药用价值。东莨菪碱与莨菪碱相比，具有不良反应少、药理作用更强的特点，被大量用于镇痛、麻醉、抗晕动症、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾以及治疗农药中毒等领域，市场需求极为庞大。然而，东莨菪碱在植物中的含量相较于莨菪碱低很多，在东莨菪碱的商业药源植物颠茄中，其含量仅占干质量的0.01%-0.08%，这直接导致东莨菪碱价格高昂。

长期以来，科研人员尝试通过多种常规方法来培育东莨菪碱高产的药源植物，如常规育种、脱毒、杂交育种、射线诱变育种、多倍体育种等，但均未取得理想成果。随着TAs生物合成途径分子生物学和东莨菪碱药源植物基因工程研究的不断深入，代谢工程逐渐成为培育高产TAs药源植物最具潜力的突破方向。

托品烷类生物碱生物合成途径起始于鸟氨酸和精氨酸，经过一系列酶促反应生成托品酮，托品酮在托品烷类生物碱生物合成中处于关键分支点位置。托品酮在托品酮还原酶I（TRI）催化下生成托品，托品是莨菪碱和东莨菪碱等药用TAs的直接前体；而在托品酮还原酶II（TRII）催化下生成假托品，假托品是打碗花精的直接前体，对于目标产物莨菪碱和东莨菪碱而言，由TRII主导的假托品生物合成途径是TRI主导的托品生物合成途径的竞争途径。由此可见，TRI基因在托品烷类生物碱合成途径中占据着核心地位，它的表达情况和功能特性对莨菪碱和东莨菪碱的合成起着关键作用。

本研究旨在对颠茄TRI基因进行克隆，深入验证其功能，并探究超量表达TRI基因对颠茄托品烷生物碱合成的影响。通过这些研究，期望揭示TRI基因在托品烷生物碱合成过程中的分子机制，为利用基因工程技术提高颠茄中东莨菪碱和莨菪碱的含量提供坚实的理论依据和技术支撑，从而推动高产托品烷生物碱药源植物的培育进程。

1.2国内外研究现状

托品烷类生物碱生物合成途径的研究一直是植物次生代谢领域的研究热点。国内外众多科研团队围绕其开展了大量工作，目前已取得了较为系统的认识。从起始原料鸟氨酸和精氨酸出发，经过鸟氨酸脱羧酶（ODC）、精氨酸脱羧酶（ADC）、N-甲基-腐胺转移酶（PMT）、二胺氧化酶（DAO）等一系列酶的作用，最终生成托品烷类生物碱生物合成途径的关键中间产物托品酮，这一系列反应步骤已被清晰解析。

在TRI基因的研究方面，国内外学者已从多种茄科植物中克隆鉴定出TRI基因，对其基因结构、编码蛋白的氨基酸序列等方面有了一定了解。研究发现，不同茄科植物的TRI基因在编码区序列和基因表达时空特异性上存在差异。如曼陀罗TRI基因编码273个氨基酸的酶，莨菪TRI和TRII在氨基酸序列上具有64%的一致性，且编码这两个酶的基因组序列具有相同的组织结构。在酶动力学特性方面，TRI和TRII虽然都以托品酮为底物，但催化作用不同，TRI催化生成托品，TRII催化生成假托品。在pH值为7.0时，曼陀罗TRI酶活性是TRII的11倍，且TRI在高Km值及酸性环境条件下，能达到其最高的酶活。

然而，当前研究仍存在诸多不足。在TRI基因功能验证方面，虽然已经明确其在托品烷生物碱合成途径中的关键作用，但对于TRI基因在不同环境条件下以及与其他基因相互作用时的功能变化，还缺乏深入系统的研究。在超量表达TRI基因对托品烷生物碱合成影响的研究中，目前的研究多集中在模式植物或少数茄科植物中，对于颠茄这一重要的商业药源植物，相关研究还不够全面和深入，尤其是TRI基因超量表达后对颠茄整体生长发育以及其他次生代谢产物合成的影响，尚有待进一步探究。

1.3研究意义

本研究对颠茄TRI基因展开深入研究，在理论和实践方面均具有重要意义。

在理论层面，TRI基因是托品烷生物碱合成途径中的关键基因，对其进行克隆、功能验证及超量表达研究，有助于从分子水平上更深入、全面地揭示托品烷生物碱的生物合成机制。通过探究TRI基因的表达调控模式、与其他基因的互作关系以及在不同环境信号下的响应机制，能够丰富我们对植物次生代谢调控网络的认识，为植物次生代谢领域的理论发展提供新的研究思路和数据支持，进一步完善植物基因功能与代谢途径之间的联系。

从实践角度出发，颠茄作为莨菪碱和东莨菪碱的重要商业药源植物，提高其托品烷生物碱含量具有极高的应用价值。本研究通过超量表