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细胞生物学与医学遗传学实验指南

细胞生物学与医学遗传学实验是连接基础理论与临床应用的重要桥梁，其核心在于通过规范操作揭示细胞结构功能、遗传物质变异与疾病发生发展的内在联系。实验过程需严格遵循科学性、规范性与安全性原则，以下从实验前准备、基本操作技术、经典实验项目、数据记录与分析及注意事项五部分展开详细说明。

一、实验前准备

（一）实验室安全规范

实验前需明确生物安全等级（一般医学遗传学实验为BSL-2级），穿戴符合要求的防护装备（白大褂、手套、护目镜）。操作生物样本（如血液、细胞株）时需在生物安全柜内进行，避免气溶胶扩散；使用危险试剂（如DMSO、溴化乙锭）需在通风橱中操作，废弃液体需分类收集（如含酸废液、含重金属废液）并按实验室规范处理，固体废弃物（如枪头、离心管）需经高压灭菌后丢弃。实验区域需每日清洁消毒（75%乙醇擦拭台面，紫外灯照射30分钟），灭火器、洗眼器等应急设备需定期检查确保可用。

（二）试剂与器材准备

1.试剂配制与保存：细胞培养液（如DMEM）需现用现配，添加10%胎牛血清（FBS）、1%双抗（青霉素-链霉素）后过滤除菌，4℃避光保存不超过2周；胰酶消化液（0.25%胰酶+0.02%EDTA）需分装至15mL离心管，-20℃冻存避免反复冻融；分子生物学实验中，DNA提取缓冲液（含Tris-HCl、EDTA、SDS）需pH调至8.0，4℃稳定保存3个月；PCR反应体系（2×TaqMasterMix、引物、模板DNA）需冰上配制，避免酶失活。

2.仪器校准与检查：离心机使用前需平衡转子（对称位置放置等重离心管），最大转速不超过转子耐受值；倒置显微镜需检查物镜清洁（无油污、灰尘），光源亮度调节至视野均匀；PCR仪需定期校准温度（尤其退火温度），确保扩增效率；超净工作台需检测风速（0.3-0.5m/s）与沉降菌数量（≤3个/皿），符合要求后方可使用。

（三）实验设计原则

实验需遵循“随机、对照、重复”原则。例如检测某基因敲除对细胞凋亡的影响时，需设置空白对照组（未处理细胞）、阴性对照组（转染空载体细胞）、实验组（转染敲除载体细胞），每组设置3个复孔；样本量需通过预实验确定（如CCK-8实验中，细胞接种密度预实验显示5000个/孔时OD值线性范围最佳）；关键步骤（如细胞消化时间、PCR退火温度）需设置梯度优化（如胰酶消化时间设5min、8min、10min三组，筛选最佳条件）。

二、基本操作技术

（一）细胞培养技术

1.原代细胞分离：以人皮肤成纤维细胞为例，取手术切除的正常皮肤组织（经患者知情同意），PBS冲洗3次去除血污，剪至1mm3碎块，加入0.2%胶原酶Ⅱ（终浓度），37℃振荡消化4小时。1000rpm离心5分钟收集细胞，完全培养基重悬后接种于25cm2培养瓶，置于37℃、5%CO?培养箱，24小时后换液去除未贴壁细胞。

2.传代培养：当细胞融合度达80%-90%时进行传代。弃去旧培养基，PBS冲洗2次，加入1mL胰酶消化液（37℃预温），显微镜下观察至细胞间隙增大、部分细胞变圆（约2-3分钟），立即加入2mL含血清培养基终止消化。吹打细胞至单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，沉淀用新培养基重悬后按1:3比例传代。

3.细胞冻存与复苏：冻存液配方为90%FBS+10%DMSO（现用现配），取对数生长期细胞，消化后离心收集，冻存液重悬调整密度至1×10?个/mL。将细胞悬液加入冻存管，放入程序降温盒（内装异丙醇），-80℃冰箱过夜后转移至液氮长期保存。复苏时从液氮取出冻存管，37℃水浴快速融化（1分钟），10倍体积培养基稀释，1000rpm离心5分钟去除DMSO，沉淀接种于培养瓶，24小时后换液。

（二）分子生物学技术

1.基因组DNA提取（柱提法）：取200μL全血，加入20μL蛋白酶K（20mg/mL）与200μL裂解缓冲液（含1%SDS、50mMTris-HCl、20mMEDTA），56℃孵育1小时至溶液澄清。加入200μL无水乙醇混匀，转移至吸附柱，12000rpm离心1分钟。依次用700μL洗涤液1、500μL洗涤液2离心洗涤，最后将吸附柱置于新离心管，加入50μL洗脱缓冲液（65℃预温），静置2分钟后12000rpm离心1分钟收集DNA。Nanodrop检测OD260/OD280应在1.8-2.0之间，浓度≥50ng/μL。

2.PCR扩增：反应体系（25μL）：2×TaqMasterMix12.5μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，模板DNA（50ng/μL）2μL，ddH?O8.5μL。扩增程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，退火（根据引物Tm值，通常55-60℃）30秒，72