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毕赤酵母表达蚓激酶基因的关键技术与应用前景探究

一、引言

1.1蚓激酶概述

蚓激酶（Lumbrokinase）是一类从蚯蚓体内提取得到的蛋白水解酶，作为一种具有独特生理活性的生物酶，在医学领域尤其是心脑血管疾病治疗方面展现出了重要的应用价值，近年来受到了广泛的关注和深入的研究。

从来源上看，蚓激酶主要取自各种蚯蚓品种，不同种类的蚯蚓所提取出的蚓激酶在组成和活性上可能存在一定差异。其结构较为复杂，由多个亚基组成，是一种糖蛋白，包含蛋白质和多糖两部分，其中蛋白质部分具有特异性，能够识别并作用于特定的底物，分子量通常在20-40kDa之间，这种结构赋予了蚓激酶独特的功能特性。

在功能方面，蚓激酶具有直接降解血中纤维蛋白原及激活纤溶酶原为纤溶酶的能力，通过激活血管内皮细胞表面的受体，促使纤溶酶原转化为纤溶酶，进而降解纤维蛋白原和纤维蛋白，达到溶解血栓的目的，具有良好的体内外溶栓抗凝作用。它还能降低血液粘稠度、减少血小板聚集、改善微循环，在心脑血管系统中发挥着全方位的调节作用。

在心脑血管疾病治疗中，蚓激酶发挥着关键作用。它可以用于抗凝治疗，通过抑制凝血因子的合成和释放，减少血液凝固，预防血栓的形成；对于已经形成的血栓，蚓激酶能够促进纤溶酶原转化为纤溶酶，降解纤维蛋白原和纤维蛋白，溶解血栓，起到溶栓治疗的作用；对于有血栓形成风险的人群，如高血压、糖尿病、高血脂、高龄老人等，蚓激酶可作为预防性治疗药物，有效降低血栓形成的风险，降低心脑血管事件的发生率；在心脑血管疾病治疗过程中，如冠状动脉搭桥术、心脏瓣膜置换术等手术，使用蚓激酶可以降低术后血栓形成的风险，提高手术成功率。

蚓激酶作为溶栓药物，先后在韩国和中国上市，大量的临床实践和研究都证实了其在心脑血管疾病治疗中显著的疗效，能够有效改善患者的病情，提高患者的生活质量和生存率。然而，尽管蚓激酶在治疗心脑血管疾病方面表现出较高的安全性，但仍有少数患者出现过敏反应或其他不良反应，在使用时需要医生根据患者的具体情况调整剂量和使用频率，并进行必要的监测。

1.2毕赤酵母表达系统

毕赤酵母（PichiaPastoris）表达系统是一种甲醇营养型酵母菌表达系统，自20世纪60年代被发现以来，经过多年的研究和发展，已经成为生物技术领域中一种重要的重组蛋白表达生产系统。与其他表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有诸多显著的优势，使其在生物制药、工业酶生产等领域得到了广泛的应用。

从培养条件来看，毕赤酵母培养条件简单经济，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。其生长培养液的组分主要包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，这些成分廉价而无毒，为大规模工业化生产提供了有利条件。在以甲醇为唯一碳源的培养基中，毕赤酵母能够快速生长，这一特性使其在发酵过程中可以通过精确控制甲醇的添加来调控外源基因的表达。

在蛋白修饰能力方面，作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具备糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能，能够对表达的外源蛋白进行正确的折叠和修饰，使其更接近天然蛋白的结构和功能。与酿酒酵母相比，毕赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面具有明显优势，其N-连接糖基化修饰后的蛋白一致性高，且不产生具有免疫原性的α-1,3糖苷键，所表达的生物制品安全性更好。

毕赤酵母表达系统在表达调控上也拥有明显优势。它可以使用AOX1启动子表达外源蛋白，这是一种非常严谨控制的高表达诱导体系，只有在甲醇存在的情况下，外源基因才会被诱导表达，不会存在表达泄露问题，同时表达水平也很高，能比酿酒酵母高10-100倍，媲美大肠杆菌表达系统。此外，毕赤酵母还含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP）启动子，用于高水平的组成型表达。其表达载体以整合进入基因组的方式存在，菌株表达稳定性高、可靠性强，避免了质粒丢失等问题。

毕赤酵母表达系统还具有发酵工艺成熟，易放大的特点。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，细胞干重达100g/L以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升，能够满足工业化大规模生产的需求。

正是由于毕赤酵母表达系统具备这些突出的优势，使其成为目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，越来越受到科研人员和工业界的青睐，在生产各种重组蛋白，如激素、疫苗、血液相关制品、细胞因子和酶等方面发挥着重要作用。

1.3研究目的与意义

本研究旨在获得能够高效表达蚓激酶的毕赤酵母菌株，通过基因工程技术，将蚓激酶基因导入毕赤酵母中，利用毕赤酵母表达系统的优势，实现蚓激酶的高效表达。

当前，蚓激酶作为一种有效的抗血栓药物，在心脑血管疾病治疗中具有重要地位，但传统的从蚯蚓中提取蚓激酶的方法存在诸多局限性，如提取过程复杂、产