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牛结核病新型检测技术的构建与应用：基因芯片与荧光定量PCR的突破

一、引言

1.1研究背景与意义

牛结核病（BovineTuberculosis,BTB）是一种由结核分枝杆菌（Mycobacteriumbovis,M.bovis）引起的呈世界分布的人畜共患慢性传染病，严重危害人类身体健康和公共卫生安全，阻碍畜牧业生产和经济发展。据世界动物卫生组织（OIE）报道，全球每年约有2000万头牛感染结核病，造成的经济损失高达数亿美元。在我国，牛结核病同样是一个重要的公共卫生问题，据中国动物卫生与流行病学中心统计，2019年全国共报告牛结核病疫情312起，涉及牛只6349头。牛结核分枝杆菌随鼻分泌物、粪尿和乳汁等排出体外，污染饲料、饮水、环境，使其在人畜之间相互传播。未经消毒或消毒不完全的患病牛的牛奶可传染人，尤其是牧民和兽医等长期接触牛群的人群。因此，牛结核病不仅对牛只的健康产生严重影响，还可能传染给人，对畜牧业生产和公共卫生构成了严重威胁。

传统的结核病诊断方法，如细菌学分离鉴定、PPD皮内变态反应等，相对费时费力，已不能满足大型规模化养殖企业快速、准确检疫的要求。随着现代分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应（PCR）技术被广泛应用于疫病诊断、动物性食品卫生安全等领域。基因芯片检测技术和荧光定量检测方法作为新型的分子生物学检测技术，具有快速、灵敏、准确等优点，为牛结核病的诊断和防控提供了新的思路和方法。因此，建立牛结核病基因芯片检测技术和牛分支杆菌荧光定量检测方法，对于快速、准确地诊断牛结核病，及时采取防控措施，保障畜牧业生产安全和公共卫生安全具有重要的意义。

1.2国内外研究现状

在国外，基因芯片技术在牛结核病检测方面的研究开展较早。一些研究通过对牛结核分枝杆菌的全基因组分析，筛选出特异性的基因片段作为探针，构建基因芯片用于检测牛结核病。这些研究在实验室条件下取得了较好的检测效果，能够快速准确地鉴定牛结核分枝杆菌，并且对不同菌株的区分能力也较强。同时，国外在牛分支杆菌荧光定量检测方法上也有诸多成果，已经建立了多种基于不同原理的荧光定量PCR检测体系，部分方法已经应用于实际的奶牛场监测和鲜乳污染状况评估，为牛结核病的防控提供了有效的技术支持。

国内在牛结核病基因芯片检测技术和牛分支杆菌荧光定量检测方法方面也进行了大量研究。一些科研团队针对我国牛结核分枝杆菌的流行特点，筛选出适合国内情况的特异性基因，设计并优化基因芯片，提高了检测的灵敏度和特异性。在荧光定量检测方法上，国内学者通过对引物和探针的设计优化，建立了具有良好特异性和重复性的检测方法，能够对牛体内的分支杆菌进行定量检测，为疫情监测和防控提供了数据支持。但目前这些技术在实际应用中仍存在一些问题，如检测成本较高、操作复杂等，限制了其大规模推广应用。

1.3研究目标与内容

本研究旨在建立牛结核病基因芯片检测技术和牛分支杆菌荧光定量检测方法，并对其性能进行评估，为牛结核病的诊断和防控提供技术支持。具体研究内容如下：

牛结核病基因芯片检测技术研究：通过对牛结核病相关基因的筛选和鉴定，设计针对牛结核病相关基因的芯片并进行实验验证，建立牛结核病基因芯片检测技术，并对其进行优化和完善，提高检测的灵敏度和准确性。

牛分支杆菌荧光定量检测方法的建立：利用分子生物学技术建立牛分支杆菌荧光定量检测方法，包括分离纯化、DNA提取、PCR扩增、荧光定量等步骤，并通过实验验证其能够检测出牛体内的分支杆菌数量，建立一套稳定可靠的检测方法。

两种检测方法的性能评估：对建立的牛结核病基因芯片检测技术和牛分支杆菌荧光定量检测方法进行特异性、敏感性、重复性等性能评估，并与传统检测方法进行对比分析，评价其在实际应用中的可行性和优势。

二、牛结核病基因芯片检测技术研究

2.1技术原理

基因芯片技术，又被称为DNA芯片或DNA微阵列，其核心原理是基于核酸分子杂交配对特性。通过光导原位合成、显微印刷等技术手段，将大量特定序列的探针分子有序且密集地固定在经过特殊处理的载体上，如硅片、玻片、硝酸纤维素膜等。当加入带有标记的待测样品后，样品中的靶基因片段会依据碱基互补配对原则，在适宜条件下与芯片上的探针进行多元杂交。杂交完成后，通过检测杂交信号的强弱以及分布情况，便能对目的分子的存在与否、数量多少以及序列信息进行分析，进而获取受检样品的遗传信息。

在牛结核病检测中，选取牛分枝杆菌和结核分枝杆菌中相对保守且特异的核酸序列作为检测的靶片段。这些靶片段具有独特的基因特征，能够准确地代表牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的存在。针对这些靶片段设计特异性的引物和探针，引物用于在PCR扩增过程中特异性地扩增靶基因片段，使其数量大幅增加，便于后续检测。探针则固定在芯片上，与经过扩增、标记的样品靶