实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座.pptxVIP

试验目标

1.掌握细胞传代培养方法

2.掌握细胞冻存方法

3.建立严格无菌操作观念

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试验原理

传代培养是组织培养常规保种方法之一，也是

几乎全部细胞生物学试验基础。

当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种

成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传

代。传代培养可取得大量细胞供试验所需。

传代要在严格无菌条件下进行。

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试验原理

l利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保留，能

够使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特征保留起来，

这么在需要时候再复苏细胞用于试验，起到了细胞保

种作用。还能够利用细胞冻存形式来购置、寄赠、交

换和运输一些细胞。

l细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%-15%

甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加

之在迟缓冻结条件下，细胞内水分透出，降低了冰晶

形成，从而防止细胞损伤。采取慢冻快融方法能很

好地确保细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-

2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可

实验三细胞的传代培养直与冻接存专投家讲座入液氮内(-196℃)。第3页

低温保护剂

细胞直接冻存会造成细胞死亡。必须加低温保护剂。

惯用：二甲亚砜（DMSO）。是一个渗透性保护剂。

机理：可快速透入性别，降低冰点，提升细胞膜对水通透

性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞

外，在胞外形成冰晶，提升细胞内电解质浓度，降低胞

内冰晶，从而降低冰晶对细胞冻伤。

浓度：5~10%，细胞冻存1~2年，存活率80~90%。

二甲亚砜有一定毒副作用，能引发蛋白质变性。解冻后，

细胞出现凝集现象。用于病人可出现心律失常、高血压

等症状。

当前，造血干细胞冻存时，采取5％DMSO+6%HES（羟

乙基淀粉）两种冷冻保护剂。

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试验材料

l癌细胞；

l10%胎牛血清和DMEM培养液；消化液（0.25%胰蛋

白酶-0.02%EDTA溶液）；D-Hank’s液；冻存液

l细胞培养皿；离心管；冻存管；微量移液器

l75％酒精棉球；酒精灯1台；废液缸

l液氮；二氧化碳

l显微镜；细胞培养箱

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lNCI-H460

lSPCA1

lKYSE30

lKYSE510

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操作步骤

l弃去细胞瓶中原有培养液。

l加入适量D-Hank’s液(1mL)，轻轻摇动，洗去老化细胞

及残留培养液。重复两次。

l加入适量消化液(1mL)，轻轻摇摆至平铺细胞瓶底层，

37℃静置2min，直至细胞层发白、卷边、有间隙，

即将脱落，加入3mL营养液终止消化。

l用吸管重复均匀吹打瓶壁，使细胞脱落，并形成单个

细胞状态向细胞沉淀中再加入6ml营养液制成细胞悬液，

分别加入新细胞培养瓶中（5mL/瓶），拧好瓶盖，放

入培养箱中。37℃培养24h后观察结果。

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操作步骤

l弃去细胞瓶中原有培养液。

l加入适量D-Hank’s液(1mL)，轻轻摇动，洗去老化细胞

及残留培养液。重复两次。

l加入适量消化液(1mL)，轻轻摇摆至平铺细胞瓶底层，

37℃静置2min，直至细胞层发白、卷边、有间隙，

即将脱落，加入3mL营养液终止消化。