利用PCR反应进行人类性别鉴定.pptVIP

实验八PCR反应鉴定人类性别;二、PCR反应的原理;PCR主要由反复循环的变性、退火和延伸三个步骤构成：即在高温（95℃）下，使靶DNA双链受热变性成为两条单链；而后在低温（37～55℃）下，两条寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，经过一次循环目的DNA产物增加1倍。如此反复进行，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增。

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;引物

PCR反应的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由引物限定的。

引物长度至少应含有16个核苷酸，最好长达20-24个核苷酸。这种长度的引物在聚合反应温度下不会形成稳定二聚体。

PCR反应中引物的终浓度通常为1μmol/L.当PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。;缓冲液

提供TaqDNA聚合酶最适酶促反应条件。常用的缓冲体系为50MmKCl，10mM?Tris-HCl(pH8.3,RT)。

另外还需要一定浓度的Mg2+，一般浓度为1.5mM。这是TaqDNA聚合酶活性所必需。另外它还影响着引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。;脱氧核苷三磷酸（dNTP）

作为DNA合成的基本原料。dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合时的错误掺入，因此应当避免。一般在200μmol/L浓度下使用。;温度循环参数

变性温度与时间

通常选用95℃30s。

复性温度与时间

复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但是容易出现错配，温度太高不利于复性，通常为55℃左右。

延伸温度与时间

一般为72℃。这个温度即考虑了TaqDNA聚合酶的活性，又考虑到引物和靶基因的结合。

循环数

循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。

;三、利用PCR反应进行性别鉴定;五、实验步骤;2.设置对照：

空白对照

阴性对照

阳性对照;（三）、扩增参数