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食源性细菌的分子生物学检测

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，很多适合于食源性细菌检测和分析的分子生物学方法，这些方法具有操作简便、快速、灵敏度高等特点，通常只需24～48h就可以获得检测结果。

核酸分子杂交和PCR技术，相当成熟和完善

;一、样品的前处理

获得一定纯度和一定数量的靶细菌(待检测目标细菌)的DNA作为分子杂交的材料或PCR的模板。

食品的组成复杂，而且食品中除了有靶细菌外，往往还存在很多非靶微生物，在很多情况下从食品样品中获得靶DNA所消耗的时间、精力和费用往往比应用分子生物学技术检测它们要长(高)得多。

前处理主要包括靶细菌的富集浓缩

样品中PCR抑制剂的去除

;(一)靶细菌的富集

虽然有些分子生物学技术，例如增敏PCR能够检测出样品中很少数量甚至一个靶细菌，为提高灵敏度和检测结果的可靠性，往往需要对样品中的靶细菌进行富集。（5种）

1、采用选择性培养基成分和选择性培养条件富集

增殖可增加靶细菌，还可以降低样品中对分子生物学技术存在干扰的物质（PCR抑制剂），增殖培养还可使一些处于亚活力状态的细菌恢复活力，从而提高检测的灵敏度和准确性.

2．离心或过滤方法

浓缩靶细菌，增加靶细菌相对数量的方法。它无需对样品增殖培养，因此不会延长检测时间，也不破坏“原始性”，一般仅适合于牛奶等液体食品。

;3．免疫吸附富集法

免疫磁珠分离技术(immunomagneticseparationtechniques

免疫乳胶分离技术(immuno-latexseparationtechniques)

与离心过滤方法一样，由于无需培养，因此不会延长检测时间，也不会破坏样品的“原始性”。

;4、外源凝集素(1ectin)凝集法：外源凝集素（植物糖蛋白），它能与细胞质膜上的特定碳水化合物结合，靶细菌通过和包被在固体微粒上的外源凝集素结合而被分离富集

5、电分离方法(electrofractionation)是根据靶细菌和其他物质(包括非靶微生物和各种化合物)所带的电荷不同而实现分离富集的方法。

免疫磁珠分离技术用得最多和最成功。;(三)死亡靶细菌对PCR扩增结果的影响

一般地，已死亡的细菌是不会危害健康的，但是有时它的(特别是加热杀死细菌)的DNA常可作为PCR的模板而得到扩增，出现假阳性，影响PCR的分析结果。

PCR的分析结果是由于已死亡靶细菌DNA产生，还是活的靶细菌DNA产生的结果?

1、用培养增殖先对样品中的靶细菌进行短时间的选择性培养增殖，然后对增殖前后的靶细菌DNA进行扩增，如果样品中没有活的靶细菌，那么增菌前后DNA的扩增结果应该没有差别

2、反转录PCR(RT-PCR)

分析样品中靶细菌的mRNA，由于mRNA半衰期很短，微生物死亡后mRNA迅速分解，这样采用反转录PCR扩增分析的mRNA一般都是活菌体的，因此同样可以消除假阳性。;

分析样品中死亡菌体的DNA

可以间接地反映食品原料在加工之前是否曾被某种微生物污染过，从而可以推测出食品中是否可能含有由这种微生物产生的毒素。

例如；通过扩增分析加热杀菌后食品样品中是否含有金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的肠毒素基因，可以间接地判断出食品中是否可能含有肠毒素。

;(四)亚活力状态靶细菌对PCR检测结果的影响

一般亚活力状态的菌体不能形成菌落，用常规分离培养方法不能检测，但是处于这种状态的病原微生物，例如沙门菌(Salmonellaspp。)对人体同样有危害，所以在用培养法检测它们时，常先要用恢复培养基对它们进行恢复性培养，然后再进行富集分离。

采用分子生物学技术分析检测，有时能够直接检测出来，有时则不能，取决于是什么因