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微生物基本实验操作技能

要领及注意事项

一、无菌操作

1、无菌概念：

什么地方是有菌的，什么地方是无菌的；

哪些地方要求基本无菌，哪些地方严格要求无菌。

2、操作环境：

实验室；接种箱；超净工作台；无菌工作室。

3、工作范围：

接种、转管、倒平板、梯度稀释、涂平板、平板划线、菌体(菌悬液)转移及其他需要无菌操作的实验环节。

一、无菌操作

4、要领及注意事项：

（以实验室接种、转管为例）

（1）斜面、接种环拿法；

（2）火焰保护；

（3）接种环灭菌；

（4）接种环冷却及轻快接触斜面；

（5）棉塞的制作及处理。

二、染色、制片

1、类型：分装片和涂片；

2、操作步骤：（以涂片为例）

1）涂片：载玻片---滴加生理盐水---挑菌涂成

薄膜；

2）干燥：室温自然干燥：

3）固定：菌面向上，火焰上过2-3次：

4）染色：滴加染色液（美蓝）,覆盖（2-3分

钟）；

5）水洗：自来水冲洗，至基本无色，晾干；

6）镜检：调节光源，低倍镜观察，高倍镜观察，

油镜观察。

三、油镜头的使用

1．工作范围：

观察细菌及相近大小的微生物，真核微生物的细胞器。

2、使用特点：

一定要用油；操作要求较高。

三、油镜头的使用

3、要领及注意事项：

（1）所用装片、涂片上一定不能有水；

（2）先用低、高倍镜观察并选好视野，并将待

观察目标调至视野正中心；

（3）注意保护镜头和片子，从侧面观察镜头进

入油系；

（4）油镜头观察时，用微调调焦距，始终按

镜、片分离方向用微调调焦距；

（5）调焦距速度一定要慢，避免焦躁,因为图象

出现的焦距范围很小；

（6）注意光线的强弱；

（7）用擦镜纸蘸取溶剂（二甲苯）擦净镜头和装

片。

四、革兰氏染色

1．工作范围：

细菌学中最重要的鉴别染色法之一，也可用于

其他微生物的鉴别中。

一般的微生物形态观察不必用革兰氏染色。

2、基本步骤：

1）初染：结晶紫染色；

2）媒染：碘液媒染；

3）脱色：乙醇脱色；

4）复染：番红复染;

五．细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌体形态的差别

（1）细菌、放线菌是原核生物，酵母菌和霉

菌是真核生物，大小不同；

（2）放线菌和霉菌是丝状菌，细菌和酵母菌

是非丝状菌；

（3）霉菌有孢子柄、子实体等特化形态，放

线菌没有。

（4）一定要注意提问，不要理解为菌落形

态。

六、用血球计数板计数微生物的数量

1．工作范围：

此法计得的是死、活菌的总数，故称总菌计数法。

2、基本步骤：

1）稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液不浓，可不必

稀释。

2）镜检计数室：在计数前，先对计数板的计数室进行镜

检。若有污物，则进行清洗。

3）加样品：盖上盖玻片，用毛细管将菌液由盖玻片边缘滴

一小滴，让其自行渗进计数室。不可有气泡。

4）显微镜计数：五分钟后，先低倍镜找计数室，后高倍镜

计数。一般以每小格5—10个菌体为宜。常选四角

和中央五个中格计数。格线上菌体只数上线和左

边线。芽大于母体一半方计。同法计另一室。

5）清洗血球计数板：自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，自行

晾干。镜检，洗净为止。

七、微生物大小的测定

1．工作范围：

原核微生物的测定一般要用油镜头；

真核微生物的测定一般用高倍镜即可；

测微尺多用来测定细菌和酵母菌，放线菌和霉菌较少。

2、操作步骤

1）目镜测微尺的标定

(1)放置目镜测微尺：测微尺刻度朝下；

(2)放置镜台测微尺：测微尺刻度朝上；

(3)校正目镜测微尺：按低、高、油顺序，使两种测微尺某一区间的

两对刻度线完全重合，按下式计算：