蛋白质的分离、纯化与鉴定-酶工程与蛋白质工程-教学.pptVIP

蛋白质的分离、纯化与鉴定

原理蛋白质分子的大小蛋白质分子的电荷特性蛋白质分子的流体动力学特性蛋白质分子的结构特性蛋白质分子的光学特性

分离纯化实验材料准备预处理蛋白质粗提蛋白质粗分级蛋白质细分级蛋白质鉴定

His-taggedprotein的分离纯化实验材料准备-LB培养工程菌预处理-离心收集菌体并重悬蛋白质粗提-超声破碎并离心蛋白质粗分级-镍亲和层析蛋白质细分级-分子排阻层析蛋白质鉴定-SDS、质谱

分级-细分分子排阻层析离子交换层析疏水层析吸附层析亲和层析电泳

鉴定纯度含量质量序列特异性

硫酸铵沉淀原理盐析：高浓度中性盐与蛋白质分子争夺水分子，同时影响蛋白质分子的电荷，从而引起在蛋白质从盐溶液中沉淀析出。特点可分级；沉淀完全；简便；经济；受温度影响大；分辨率低；影响后续处理和蛋白活性

超速离心原理不同大小、形状和性质的蛋白质分子具有不同的沉降速度。特点可分级；保持样品的活性分辨率低；设备要求高

等电点沉淀原理蛋白质分子在等电点处净电荷为零，分子间的电荷排斥消失，从而相互聚集而沉淀。特点可分级分辨率低

超滤原理利用滤膜的截留作用把蛋白质分子与其它小分子分离。特点有选择性；可用于浓缩；可用于替换缓冲液；速度快分辨率低；设备要求高；成本高

分子排阻层析原理不同大小和性质的蛋白质分子因受到的阻滞作用不同而以不同的速度流经凝胶材料。特点缓冲液没有特别限制；有选择性；可用于脱盐；可用于替换缓冲液；保持生物活性上样量有限制

凝胶介质葡聚糖凝胶:适用范围广；分辨率高；机械强度低；速度慢琼脂糖凝胶：吸附小；机械强度高；速度快；分辨率低；不耐高温聚丙烯酰胺凝胶：分辨率高；容易保存；不耐碱和高温；吸附大硅胶：机械强度高；稳定性好；寿命长；吸附强

凝胶介质阳离子交换：CM,P,S,SE,SP阴离子交换：AE,DEAE,QAE,Q

吸附层析原理不同蛋白质分子表面的极性和非极性残基的数目和分布不同，因此通过离子键、氢键、范德华力和疏水作用力与吸附剂间的相互作用大小不同。

特点羟基磷灰石吸附层析离子键、氢键；容量大疏水层析/反相层析疏水相互作用；可能引起蛋白变性

亲和层析原理利用蛋白质与其配体特异性结合而分离。特点特异性强；成本高

介质抗体-抗原酶-底物激素-受体

聚丙烯酰胺凝胶电泳电荷效应、浓缩效应；分子筛效应等电聚集电泳蛋白质分子据其等电点在pH梯度的不同位置聚集，从而分离

鉴定含量纯度质量序列特异性

含量凯氏定氮法：复杂；不准确紫外吸收法：操作简单；不破坏样品；误差较大标准比色法：准确；复杂

质量聚丙烯酰胺凝胶电泳：需要参照；受分子形状、性质影响；误差较大分子排阻层析：需要参照；受分子形状和状态影响质谱：准确；成本高

序列末端分析法测定N端（DNFB,PITC,氨肽酶法）和C端（肼解法，硼氢化钠还原法，羧肽酶法）Edman降解法测定全长序列部分酶解法二硫键位置质谱法