第四章二维电泳与细胞蛋白质的分离.pptVIP

第四章二维电泳

与细胞蛋白质的分离;

;V:泳动速度cm/秒or分

d:泳动距离cm

t:电泳时间(秒/分)

E:电场强度伏特/cm;电泳技术的基本原理;电泳技术的基本原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;电泳过程示意图

A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子

B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带

C显示蛋白质样品分离成数个区带;不连续系统浓缩效应示意图;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;SDS测定蛋白质分子量;SDS测定蛋白质分子量;SDS测定蛋白质分子量;SDS测定蛋白质分子量;SDS测定蛋白质分子量;SDS测定蛋白质分子量;标准蛋白分子量;1D-SDS分离局限性;二维电泳技术;;;二维电泳技术;第二节一维等电聚焦电泳;一、IEF凝胶的制备;等电聚焦电泳;合成载体两性电解质

(1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度；

(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场；

(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开；

(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。;SCA的缺陷：

SCA本身就是通过复杂的合成过程得到的，其重复性很难控制，这样从一开始就限制了2-DE分离的重复性；

SCA分子相对较小，难以在IEF胶内固定，在IEF过程中由水合正离子引起的电渗流将致使SCA分子向负极迁移（负极漂移），导致pH值不稳定性增加。当利用管状IEF胶时，由于玻璃毛细管壁的硅羟基带负电，与这些负电荷基团对应，将在管胶表面聚集一层正电荷形成双电层，这种作用加剧了负极漂移；;SCA的缺陷：

负极漂移作用对碱性区蛋白质的影响尤其严重，结果常导致碱性区蛋白质难以成功聚焦甚至导致区蛋白质的丢失

每一次灌制SCA凝胶的重复??难以控制，凝胶的机械稳定性差，易拉伸变形或断裂，导致重复性的减低;固相pH梯度（IPG）技术;商品化的IPG胶条;;;二、加样;二、加样;加样量过大;三、运行;三、运行;没有完全聚焦或聚焦时间不够;;四、IPG胶条的平衡;四、IPG胶条的平衡;四、IPG胶条的平衡;四、IPG胶条的平衡;第三节二维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;二维SDS;二维SDS;水平SDS

必须有6％的浓缩胶，均一或梯度的分离胶

凝胶附着在塑料支持膜上，在染色过程中可以防止凝胶大小发生变化

水平胶厚度较小（一般在o.5mm,垂直胶为1mm或1.5mm），可施加高电压，减短运行时间，减少蛋白质扩散，使得水平胶分离蛋白质点的边缘要比垂直胶清晰

凝胶聚合均匀，边缘效应小，蛋白质点的分布变形程度小;垂直SDS

避免二向电泳时胶条在电极液中移位，需用0.5％的琼脂糖电极缓冲液封胶

封胶应注意琼脂糖溶液的温度不能太高

会造成IPG胶上蛋白质变性或蛋白质修饰

避免在封胶时引入气泡

无需浓缩胶

IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶

可成批二向SDS同时运行以获得最好的图谱重复性

操作简单、上样量大、重复性好;胶在聚合过程中未被水覆盖或水太少;不是所有蛋白特别是高分子量蛋白都与SDS结合;非正常聚合