P210T315I--BCRABL转基因小鼠模型的建立与鉴定.docxVIP

P210T315I--BCRABL转基因小鼠模型的建立与鉴定

一、研究背景

慢性髓性白血病（CML）是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，其发病的分子基础是9号染色体与22号染色体相互易位形成费城染色体（Ph染色体），进而产生BCR-ABL融合基因。该融合基因编码的BCR-ABL蛋白具有持续活化的酪氨酸激酶活性，可导致细胞增殖异常、凋亡受阻，最终引发白血病。

在BCR-ABL融合蛋白中，P210型是CML的主要致病亚型。然而，随着酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在临床治疗中的广泛应用，耐药问题日益凸显，其中T315I突变是最为常见且棘手的耐药突变之一。携带T315I突变的P210BCR-ABL蛋白对多种TKIs均产生耐药性，给CML患者的治疗带来极大挑战。

因此，建立能够模拟携带T315I突变的P210BCR-ABL所致CML的动物模型，对于深入研究该突变型蛋白的致病机制、筛选新的治疗药物以及探索耐药逆转策略具有至关重要的意义。转基因小鼠模型因其遗传背景明确、可操作性强等优势，成为研究人类疾病的理想工具。

二、P210T315I--BCRABL转基因小鼠模型的构建

（一）目的基因的构建

获取P210BCR-ABL基因片段：从CML患者的骨髓细胞或已构建的含P210BCR-ABL基因的质粒中，通过PCR扩增等方法获得P210BCR-ABL基因的全长片段。

引入T315I突变：利用定点突变技术，在P210BCR-ABL基因的相应位置引入T315I突变。定点突变可采用PCR介导的定点突变法，设计包含突变位点的引物，通过PCR扩增实现基因突变。

构建表达载体：将突变后的P210T315I--BCRABL基因片段插入到合适的转基因表达载体中。表达载体应包含启动子、增强子等调控元件，以确保目的基因在小鼠体内特定组织或细胞中高效表达。常用的启动子有造血细胞特异性启动子（如Vav启动子、SCL启动子等），可使目的基因在造血干细胞中表达，更好地模拟CML的发病过程。

（二）转基因小鼠的制备

受精卵的获取：选取健康的雌性小鼠（如C57BL/6小鼠）作为供体，通过超数排卵处理使其排出更多的卵子，然后与雄性小鼠交配，获取受精卵。

显微注射：在显微镜下，将构建好的含P210T315I--BCRABL基因的表达载体线性化后，通过显微注射技术将其注入到受精卵的雄原核中。

胚胎移植：将注射后的受精卵移植到假孕雌性小鼠的输卵管或子宫内，使其发育成胎儿。假孕雌性小鼠是通过与输精管结扎的雄性小鼠交配获得的。

三、P210T315I--BCRABL转基因小鼠模型的鉴定

（一）基因型鉴定

提取基因组DNA：待小鼠出生后，剪取小鼠的尾巴尖等组织，采用酚-氯仿抽提法或商业化的DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

PCR鉴定：根据P210T315I--BCRABL基因和表达载体的序列设计特异性引物，通过PCR扩增检测小鼠基因组中是否整合有目的基因。若PCR扩增出预期大小的片段，则表明该小鼠为阳性转基因小鼠。

Southernblot鉴定：为进一步确证目的基因的整合情况，可采用Southernblot技术。将提取的基因组DNA用限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，转膜后与标记的目的基因探针杂交，通过杂交信号的有无和位置判断目的基因是否整合以及整合的拷贝数等。

（二）表达鉴定

RNA水平鉴定：采用RT-PCR或实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测P210T315I--BCRABL基因在小鼠造血组织（如骨髓、脾脏等）中的mRNA表达水平。RT-PCR可检测目的基因是否转录，qRT-PCR则可对其表达水平进行定量分析。

蛋白水平鉴定：通过Westernblot技术检测P210T315I--BCRABL蛋白的表达。提取小鼠造血组织的总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后与特异性抗BCR-ABL抗体杂交，通过显色反应检测目的蛋白的表达情况。同时，可采用免疫荧光技术观察目的蛋白在细胞内的定位。

（三）表型鉴定

血液学指标检测：定期采集转基因小鼠的外周血，进行血常规检查，检测白细胞计数、血小板计数、红细胞计数等指标，观察是否出现与CML相似的血液学异常，如白细胞增多、血小板增多等。

骨髓象分析：取转基因小鼠的骨髓进行涂片，经瑞氏-吉姆萨染色后，在显微镜下观察骨髓细胞的形态和比例，判断是否存在骨髓增生异常。

病理组织学检查：对转基因小鼠的脾脏、肝脏、淋巴结等器官进行病理切片和HE染色，观察是否出现组织浸润、肿大等病理改变，以评估白血病细胞的浸润情况。