7-8动物基因工程.pptVIP

第七章动物基因工程;动物基因工程是利用DNA重组技术对动物所进行的工程操作,获得携带外源基因并能稳定遗传的动物。

从遗传学角度分为：

遗传性动物基因工程：外源基因能够通过配子进行垂直传递并稳定的遗传。

非遗传性动物基因工程：转基因仅在当代表现，不能够遗传给子代。;第一节动物基因工程的发展状况与趋势;;HBV转基因动物树鼩

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从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法外，人们先后试过反转录病毒载体介导法、精子介导法、胚胎干细胞介导法和核移植法等多种转基因方法。

转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生产的主流方法。;转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定点整合。

为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了含有位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件，可以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。LCR和MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插入什么位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基因的表达。

基因打靶技术的出现与发展，实现了对目的基因的定位操作。

;一、动物基因工程载体;动物基因工程载体;1.质粒型表达载体;以山羊乳腺特性表达载体pBC1为例;2.病毒载体;3）SV40瞬时表达载体;;;（1）腺病毒（adenovirus）;ITR：反向重复序列

E1-E4：早期基因，与病毒基因组复制的起始和晚期基因的表达调控有关

L1-L5：晚期基因，病毒包装蛋白

Ψ：包装信号

IVa2和VA：病毒型RNA聚合酶III的亚基基因，与宿主细胞的亚基装配成杂合的RNA聚合酶III;2.腺病毒载体;（2）腺相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）;AAV具有以下几个方面特点：

非致病性、无免疫原性和无炎症反应

能感染静止期的细胞，如神经元细胞

插入的外源基因表达时间长，一般能够达到1年之多

宿主范围广

热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯化

;（3）反转录病毒;逆病毒的基因组;3.定向打靶载体;（1）基因敲除:指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列???整合入受体细胞的基因组中。;（2）基因敲入;（3）基因下调（knock-down）;二、哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记;三、基因转移技术;1.物理转染法;图1.利用点穿孔法进行基因转移;（2）显微注射

显微注射是借助显微操作仪，将外源DNA分子导入受精卵的雄原核内，通过DNA在复制或修复过程中造成的缺口，把外源DNA整合到胚胎基因组中。然后再将受精卵植入假孕的动物体内，使其生长发育。出生的子代作DNA检测筛选出转入基因整合和表达的子代。它是哺乳动物最常见的转基因方法，效果稳定，导人时不受DNA分子量的限制。但是，这种方法操作复杂，转基因效率低。;（3）基因枪法

基本原理是将要转染的DNA吸附到高黏度的金属（钙或金等）颗粒上，在一种加速装置的作用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，达到转基因目的;（4）超声波法（sonoporation）

超声波增强基因转染法的主要机制是声波的空化效应导致细胞的通透性增高，而通过添加超生造影剂能降低空化域值，增强空化效应，促进外源基因进入细胞，提高基因的转染效果;2.化学转染法;图2.利用磷酸钙共沉淀法进行DNA转染;

图3.质脂体介导的基因转移;（3）原生质体融合法

含有目的基因的质粒转化细菌或酵母细胞。大量扩增，利用溶菌酶或蜗牛酶去除胞壁部分，在高盐条件下制成原生质体，然后散铺在单层培养的哺乳动物细胞上，在融和剂（如聚乙二醇）作用下，使染色体或质粒转如细胞内，实现转基因;

构建含有选择性标记的反转录病毒基因组部分DNA与质粒的杂合型载体分子，在多克隆位点插入外源基因形成重组DNA分子，克隆到大肠杆菌中扩增鉴定；重组DNA分子通过物理或化学方法转入一个特制的病毒包装细胞系。转染入包装细胞系的重组DNA转录出相应的重组RNA分子，包装细胞系分泌出来的重组反转录病毒，便可感染其他类型动物受体细胞，重组RNA分子以DNA形式整合到染色体上，并表达外源基因。

;图4逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因;第三节转基因动物制备;一转基因动物的制备程序;DNAMicroinjectionofFertilizedOocyte;显微注射技术;1、DNA显