细胞培养中常见微生物污染检测 ATP荧光法标准立项修订与发展报告.docx

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《细胞培养中常见微生物污染检测ATP荧光法》标准立项与发展研究报告

EnglishTitle:ResearchReportontheStandardizationProjectandDevelopmentofATPBioluminescenceMethodforDetectingCommonMicrobialContaminationinCellCulture

摘要

随着细胞治疗、再生医学及生物制药等前沿领域的迅猛发展，细胞培养作为核心技术环节，其质量控制与安全性评估的重要性日益凸显。微生物污染是细胞培养过程中最常见且危害最严重的风险之一，可导致细胞死亡、功能异常、产物污染，甚至引发严重的临床不良反应。传统的微生物检测方法（如药典规定的培养法）虽结果可靠，但耗时过长（通常需数日至数周），无法满足细胞制剂等短保质期产品对快速放行的迫切需求。而基于核酸的检测技术则存在前处理复杂、难以覆盖未知或广谱微生物的局限性。

本报告旨在系统阐述《细胞培养中常见微生物污染检测ATP荧光法》行业/团体标准的立项背景、目的意义、技术内容及其对产业发展的推动作用。该标准基于三磷酸腺苷（ATP）生物发光原理，通过检测所有活体微生物细胞内恒存的ATP，可在10分钟内实现对细菌、真菌及支原体等常见污染物的快速、灵敏、广谱检测。报告详细分析了该标准相较于传统方法的先进性，明确了其适用范围涵盖各类细胞制品及液体培养物。标准的制定与实施，将填补细胞制剂微生物污染快速检测技术标准的空白，为细胞产品的生产质控、临床前研究及最终放行提供关键的技术依据，对保障细胞治疗安全性、加速细胞产业标准化与规范化进程具有重大战略意义。

关键词：细胞培养；微生物污染；ATP荧光检测法；快速检测；质量控制；标准化；细胞治疗；生物发光

Keywords:CellCulture;MicrobialContamination;ATPBioluminescenceAssay;RapidDetection;QualityControl;Standardization;CellTherapy;Bioluminescence

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正文

一、立项背景与目的意义

微生物污染是细胞培养实验室和生产环境中面临的最严峻挑战之一。在体外培养体系中，营养丰富的培养基为细菌、真菌、支原体等微生物的滋生提供了理想条件。一旦发生污染，将导致细胞生长抑制、形态改变、代谢异常、甚至大规模死亡，严重影响实验数据的可靠性与细胞产品的安全性、有效性。对于旨在用于临床治疗的细胞制剂（如干细胞、免疫细胞等），微生物污染更是直接关乎患者生命安全的红线问题。

目前，我国对于生物制品无菌检查的主要依据是《中华人民共和国药典》中规定的微生物限度检查法。该方法主要依赖于传统的平板培养法，其优势在于结果直观、可靠，是微生物检测的“金标准”。然而，其致命的缺点在于检测周期过长，细菌培养通常需要3-5天，真菌需5-7天，而支原体检测甚至需要长达28天。细胞制剂，尤其是某些活细胞产品，从完成制备到临床输注往往只有数小时至几天的窗口期，传统方法无法在产品放行前提供检测结果，形成了巨大的质量安全风险。

为应对快速检测的需求，基于核酸（如PCR、qPCR、NGS）的检测技术得到了发展。但这些方法通常需要复杂的样品裂解、核酸提取与扩增步骤，检测通量受限，且多为针对特定已知病原体的靶向检测，难以应对未知或混合微生物污染的场景。此外，核酸检测无法区分活菌与死菌的核酸残留，可能造成假阳性判断。

在此背景下，建立一种快速、广谱、灵敏且能区分微生物活性的检测方法成为细胞产业的迫切需求。三磷酸腺苷（ATP）荧光检测法（又称生物发光法）为此提供了卓越的解决方案。该方法的原理源于萤火虫发光机制：在荧光素酶和镁离子存在下，ATP与荧光素反应产生光信号，其发光强度与ATP浓度成正比。由于ATP是所有活体细胞（包括微生物）能量代谢的通用分子，且含量相对恒定（细菌约2.5x10?1?摩尔/细胞，真菌约5.0x10?1?摩尔/细胞），通过裂解微生物细胞释放ATP并进行检测，即可在极短时间内（通常10分钟）定量反映样品中活微生物的总量。

大量方法学验证研究表明，ATP荧光检测结果与经典菌落计数法具有高度一致性，证实了其检测的可靠性与适用性。该技术已在食品工业、环境卫生监测等领域成熟应用多年。因此，将其标准化并引入细胞培养质量控制体系，旨在：

1.填补标准空白：响应《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》（国卫办科教发〔2015〕46号）等法规对微生物污染控制的要求，建立专门针对细胞制剂的快速检测技术标准。

2.提升质控效率：实现细胞培养过程监控和终产品放行的“即时检测”，大幅缩