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Vill转基因小鼠的制备

一、基因表达载体的构建

（一）目的基因的获取

通过PCR扩增技术从含有Vill基因的cDNA文库或基因组DNA中获取目的基因。设计特异性引物，引物需包含合适的酶切位点，以便后续与载体连接。PCR反应体系包括模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶及缓冲液等，反应条件根据引物的Tm值和基因长度进行优化，确保扩增出特异性的Vill基因片段。扩增完成后，采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，回收纯化目的基因片段。

（二）载体的选择

选择适合在小鼠体内表达的载体，如pCDNA3.1等。该载体应含有复制原点、筛选标记基因（如氨苄青霉素抗性基因）以及多克隆位点，方便目的基因的插入和后续的筛选。

（三）载体构建的具体操作

分别对回收的Vill基因片段和选择的载体进行酶切处理，使用与引物设计中相同的限制性内切酶，在适宜的反应条件下进行酶切，使目的基因和载体产生互补的粘性末端或平末端。

酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的目的基因片段和载体片段。

采用DNA连接酶将目的基因片段与载体片段连接，连接反应体系包括目的基因、载体、连接酶缓冲液和DNA连接酶，在合适的温度下反应一定时间，形成重组表达载体。

将连接产物转化至感受态大肠杆菌中，涂布于含有相应筛选标记抗生素的培养基上，培养后挑选单菌落进行培养。

提取质粒，通过酶切鉴定和测序验证，确保重组表达载体中Vill基因的序列正确且插入方向正确。

二、显微注射法导入重组载体

（一）受精卵的准备

选择健康的雌鼠作为供体，通过注射促性腺激素进行超数排卵处理，然后与雄鼠交配，次日收集受精卵。

收集的受精卵在含有M2或KSOM等培养液的培养皿中培养，培养环境为37℃、5%CO?的恒温培养箱，确保受精卵保持良好的发育状态。

（二）显微注射操作

准备显微注射系统，包括倒置显微镜、显微操作臂、注射针和持卵管等。注射针选用内径约0.5-1μm的玻璃针，经拉针仪拉制而成，并在显微镜下用锻针器处理针尖，使其平滑。

将重组表达载体用无核酸酶水稀释至合适浓度（通常为1-3ng/μL），吸入注射针中。

在显微镜下，用持卵管固定受精卵，将注射针针尖刺入受精卵的细胞质中，缓慢推动注射器，将约1-2pL的重组载体溶液注入细胞质内，避免注入细胞核。注射完成后，缓慢拔出注射针，注意避免损伤受精卵。

（三）注射后受精卵的培养

将注射后的受精卵继续在37℃、5%CO?的培养箱中培养，观察其发育情况，选取发育正常的2-细胞期胚胎用于后续移植。

三、受精卵移植到假孕母鼠

（一）假孕母鼠的制备

选择发情期的雌鼠与结扎的雄鼠交配，次日检查阴栓，有阴栓的雌鼠即为假孕母鼠，作为受精卵的受体。

（二）胚胎移植操作

将假孕母鼠麻醉，在腹部做一小切口，暴露输卵管。

用移植管吸取培养好的2-细胞期胚胎，将移植管插入输卵管壶腹部，缓慢将胚胎注入，每侧输卵管移植约10-15个胚胎。

缝合切口，将母鼠放回笼中饲养，注意保温和护理。

四、后代小鼠的基因型鉴定

（一）样本采集

待小鼠出生后2-3周，剪取小鼠尾部约0.5cm，用于提取基因组DNA。

（二）DNA提取

采用酚-氯仿法或商业化的DNA提取试剂盒提取小鼠尾部组织的基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

（三）PCR鉴定

根据Vill基因和载体的序列设计特异性引物，其中一对引物针对Vill基因，另一对引物针对载体序列与Vill基因的连接区域。

以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，同时设置阳性对照（重组载体）和阴性对照（非转基因小鼠DNA）。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若出现预期大小的条带，则初步判断为转基因阳性小鼠。

（四）Southern杂交鉴定

对于PCR阳性的小鼠，进一步采用Southern杂交进行鉴定。提取其基因组DNA，用限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将DNA转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，与标记的Vill基因探针杂交，通过显影观察杂交信号，确定转基因的整合情况。

五、其他制备方法简介

（一）逆转录病毒载体法

将Vill基因插入逆转录病毒载体中，利用逆转录病毒的感染性将目的基因导入小鼠早期胚胎细胞。该方法操作相对简单，但载体容量有限，且可能存在病毒序列整合带来的潜在风险。

（二）胚胎干细胞法

将Vill基因导入胚胎干细胞（ES细胞）中，通过筛选获得稳定整合目的基因的ES细胞，然后将其注入囊胚中，再将囊胚移植到假孕母鼠体内。该方法可以对ES细胞进行筛选和鉴定，提高转基因的准确性，但操作复杂，技术要求较高。

以上就是Vill