1 生物透射电镜TEM.pptVIP

*Peisong.xie@*冷冻固定制样技术固定脱水包埋TEM聚合活体样品超薄切片修块染色高压冷冻固定冷冻替代冷冻替代技术是指，利用甲醇、丙酮等有机溶剂在低温条件下，缓慢替代样品中所含水分。之后进行梯度升温，并进行树脂渗透，包埋与聚合。*Peisong.xie@*什么是固定？什么是化学固定，什么是冷冻固定？固定目的：最大程度保存样品生活状态的原始信息，供后续研究化学固定：利用醛类等化学物质与蛋白等的交联作用冷冻固定：瞬间冰冻，毫秒级终止一切细胞内生命活动化学固定2hr冷冻固定~30ms*Peisong.xie@*固定缓慢(戊二醛，2小时以上)蛋白质结构被破坏,抗原活性丢失改变了膜的渗透性可溶性离子及可溶性小分子丢失渗透效应导致三维结构的改变体积萎缩结构破坏产生各种假象时间分辨率低接触有毒物质:戊二醛,锇酸…快速冷冻固定→时间分辨率无损失蛋白质结构、酶/抗原活性无变化膜系统保持原有的渗透性有效固定可溶性离子及小分子降低了脂类物质的抽提无渗透效应减少体积萎缩减少结构破坏细胞保存更“真实”原始状态时间分辨率高无需接触有毒的化学试剂化学固定冷冻固定?化学固定VS冷冻固定*Peisong.xie@*化学固定VS冷冻固定草履虫*Peisong.xie@*化学固定VS冷冻固定草履虫*Peisong.xie@*化学固定VS冷冻固定KentMcDonald,METHODSINCELLBIOLOGY,Vol.79,2007,pp.23-56果蝇胚胎细胞*Peisong.xie@*化学固定VS冷冻固定KentMcDonald,METHODSINCELLBIOLOGY,Vol.79,2007,pp.23-56果蝇胚胎细胞KentMcDonald,METHODSINCELLBIOLOGY,Vol.79,2007,pp.23-56*Peisong.xie@*化学固定VS冷冻固定Murkeral,J.Micro,Vol.212,Pt1October2003,pp.81-90EBV病毒转染人B细胞株RN*Peisong.xie@*化学固定VS冷冻固定光照、视网膜*Peisong.xie@*化学固定VS冷冻固定暗适应、视网膜*Peisong.xie@*化学固定VS冷冻固定大肠杆菌*Peisong.xie@*化学固定VS冷冻固定酵母菌*Peisong.xie@*美丽的冰晶及其危害*Peisong.xie@*高压冷冻固定–HighPressureFreezing–HPF水（H2O)的物理性质，在高压下发生改变，快速冷冻固化，形成玻璃态的冰，而不形成结晶态的冰WaterIIIIIIPhasediagramofWaterTmTnTrSupercooledWater*Peisong.xie@*如何回避结晶Tm=熔点，可能形成冰晶0°CTn=晶核形成温度，一定形成冰晶-42°CTr=重结晶温度，能量不足，不再形成冰晶-137°C结晶条件低于熔点具有晶核具有能量常压：5×105°C/s，20~40μm冰的导热性很差，样品越厚，冷冻速率越低提高降温速度：液氮-液态丙烷-低温铜镜-丙烷双喷WaterIIIIIIPhasediagramofWaterTmTnTrSupercooledWater*Peisong.xie@*高压冷冻原理Tm=熔点，可能形成冰晶0°CTn=晶核形成温度，一定形成冰晶-42°CTr=重结晶温度，能量不足，不再形成冰晶-137°C结晶条件低于熔点具有晶核具有能量压力升高，Tm降低，Tn降低204.5MPa：Tm=-22°C210MPa：Tn=-92°C溶质浓度提高，溶液Tm，Tn降低，Tr提高常压：5×105°C/s，20μm高压：5×103°C/s，200μm*Peisong.xie@*冷冻固定制样技术固定脱水包埋TEM聚合活体样品超薄切片修块染色高压冷冻