蜡梅ABC转运蛋白基因CpABC的克隆与功能的初步分析.docxVIP

蜡梅ABC转运蛋白基因CpABC的克隆与功能的初步分析

摘要

本研究旨在克隆蜡梅ABC转运蛋白基因CpABC并初步分析其功能。通过hiTAIL-PCR等技术成功克隆得到该基因，生物信息学分析显示其编码蛋白具有典型ABC转运蛋白结构特征。构建原核表达载体并诱导表达，SDS检测到目的蛋白。实时荧光定量PCR分析表明，CpABC基因在蜡梅花朵不同组织和不同发育时期存在差异表达。本研究为深入探究蜡梅ABC转运蛋白功能及作用机制奠定基础。

关键词

蜡梅；ABC转运蛋白基因；基因克隆；功能分析

一、引言

ABC（ATP-BindingCassette）转运蛋白是一类广泛存在于生物界的膜蛋白超家族，利用ATP水解产生的能量跨膜转运多种物质，包括离子、代谢产物、次生代谢物以及信号分子等。在植物中，ABC转运蛋白参与众多生理过程，如植物激素运输、次生代谢产物积累、重金属解毒、气孔运动调节以及植物对生物和非生物胁迫的响应等。蜡梅（Chimonanthuspraecox）作为我国传统名花，其花具有独特香气，含有多种挥发性次生代谢物。然而，目前关于蜡梅中ABC转运蛋白基因的研究较少。本研究通过克隆蜡梅ABC转运蛋白基因CpABC，并对其进行功能初步分析，以期为揭示蜡梅香气形成机制以及植物ABC转运蛋白功能提供新的见解。

二、材料与方法

2.1实验材料

蜡梅品种‘素心蜡梅’采自西南大学花卉研究所种质资源圃。选取生长健壮、无病虫害的植株，采集不同发育时期（蕾期、初花期、盛花期、末花期）的花朵以及花被片、雄蕊、雌蕊等不同组织，迅速放入液氮中速冻，保存于-80℃冰箱备用。大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞、pET-28a（+）载体购自TransGenBiotech公司；植物总RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、反转录试剂盒、高保真DNA聚合酶等购自TaKaRa公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶等购自NEB公司。

2.2蜡梅DNA和RNA提取

采用改良CTAB法提取蜡梅基因组DNA。称取约0.1g蜡梅叶片，加入液氮研磨成粉末，转入1.5mL离心管中，加入600μL预热的CTAB提取缓冲液，65℃水浴30min，期间轻柔颠倒混匀数次。冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000rpm离心10min。吸取上清液至新的离心管，加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，可见白色絮状DNA沉淀。12000rpm离心5min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次，晾干后用适量TE缓冲液溶解DNA。

利用植物总RNA提取试剂盒提取蜡梅不同组织的总RNA。具体步骤参照试剂盒说明书进行。提取的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，Nanodrop2000测定浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间的RNA样品用于后续实验。

2.3cDNA第一链的合成

以提取的总RNA为模板，采用反转录试剂盒合成cDNA第一链。反应体系为：5×PrimeScriptBuffer2μL，Random6mers0.5μL，dNTPMixture（10mMeach）0.5μL，PrimeScriptRTEnzymeMix0.5μL，总RNA1μg，RNaseFreedH2O补足至10μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA保存于-20℃冰箱备用。

2.4CpABC基因的克隆

根据前期转录组测序获得的ABC转运蛋白基因片段，设计特异性引物（表1）。以蜡梅cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×PhantaMaxBuffer25μL，dNTPMix（10mMeach）5μL，上下游引物（10μM）各1μL，cDNA模板2μL，PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase1μL，ddH2O补足至50μL。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的条带，连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞。挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的克隆送测序公司测序。

2.5CpABC基因编码蛋白的生物信息学分析

利用NCBI的O