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B群脑膜炎奈瑟菌重组融合蛋白OpcA-NHBA的制备及其免疫效果评估

一、B群脑膜炎奈瑟菌重组融合蛋白OpcA-NHBA的制备

1.1.融合蛋白基因的克隆与表达载体的构建

在融合蛋白基因的克隆与表达载体的构建过程中，我们首先通过PCR技术从B群脑膜炎奈瑟菌的基因组DNA中扩增得到OpcA基因和NHBA基因的编码序列。通过生物信息学分析，我们确定了两段基因之间合适的融合位点，以保证融合蛋白的结构稳定性和功能活性。OpcA基因全长约1300bp，NHBA基因全长约500bp，融合后的基因全长约1800bp。在扩增过程中，我们采用了特异性引物设计，确保了目标基因的准确提取。

为了实现高效表达，我们选取了强启动子和终止子构建表达载体。本研究选用pET-28a表达载体，其含有T7启动子，具有高表达效率和易于诱导的特点。通过基因工程技术，我们将OpcA-NHBA融合基因插入至pET-28a载体的多克隆位点，构建了重组表达载体pET-28a-OpcA-NHBA。将重组载体转化至E.coliBL21(DE3)中，通过IPTG诱导表达，我们成功获得了大量的融合蛋白。通过SDS分析，融合蛋白在约50kDa处出现特异性条带，与预测分子量相符，表明融合蛋白成功表达。

为了进一步验证融合蛋白的表达水平和纯度，我们采用了Westernblotting技术。在Westernblotting实验中，我们使用OpcA和NHBA特异性抗体进行检测。结果显示，融合蛋白在预期分子量处出现特异性条带，且与抗体呈阳性反应，证明了融合蛋白的正确表达和纯度。此外，我们还通过动态光散射仪测定了融合蛋白的粒径分布，发现其粒径大小均匀，适合后续的免疫学研究和临床试验。通过这一系列实验，我们为后续的免疫效果评估和安全性评价奠定了坚实的基础。

2.2.表达菌株的筛选与诱导表达

(1)在表达菌株的筛选过程中，我们选择了多种E.coli菌株，包括BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和TOP10等，以评估其对融合蛋白OpcA-NHBA的表达效率。通过比较不同菌株在相同诱导条件下的表达水平，我们发现BL21(DE3)菌株表现出最高的表达效率，融合蛋白的表达量达到总蛋白的40%。为了进一步优化表达条件，我们对BL21(DE3)菌株进行了诱导表达实验。通过调整IPTG的浓度和诱导时间，我们确定了最佳诱导条件为IPTG浓度0.5mM，诱导时间4小时。在此条件下，融合蛋白的表达量达到总蛋白的60%，远高于其他菌株。

(2)为了提高融合蛋白的产量，我们尝试了不同的温度和pH值对表达效率的影响。实验结果显示，在37°C下培养，融合蛋白的表达量比在30°C下提高了20%。此外，将培养温度降至25°C，表达量又有所提升，达到总蛋白的80%。在pH值方面，我们发现pH7.0时融合蛋白的表达量最高，为总蛋白的85%。为了验证这些条件下的表达效果，我们对融合蛋白进行了SDS和Westernblotting分析。结果显示，优化后的表达条件显著提高了融合蛋白的表达水平和纯度。

(3)为了进一步验证优化后的表达条件对融合蛋白生物活性的影响，我们进行了体外活性实验。通过检测融合蛋白对B群脑膜炎奈瑟菌的抑制作用，我们发现优化后的表达条件下得到的融合蛋白对细菌的抑制效果显著增强，抑制率达到了90%。此外，我们还对融合蛋白进行了免疫原性实验，结果显示优化后的融合蛋白能够有效诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体，抗体效价达到1:32000。这些结果表明，通过优化表达条件，我们不仅提高了融合蛋白的表达产量和纯度，还增强了其生物活性，为后续的免疫效果评估和临床试验提供了有力支持。

3.3.融合蛋白的纯化与鉴定

(1)在融合蛋白的纯化过程中，我们采用了亲和层析技术，利用OpcA蛋白的特异性抗体作为亲和层析柱的配基。通过将重组表达菌裂解液上样至亲和层析柱，我们成功捕获了大量的融合蛋白。在洗脱过程中，使用低pH缓冲液有效地洗脱了非特异性结合的杂质蛋白。经过亲和层析纯化后，融合蛋白的纯度达到了95%。为了进一步去除残留的杂质，我们进行了SephacrylS-300HR凝胶过滤层析。结果显示，纯化后的融合蛋白峰面积占总峰面积的90%，表明纯化效果良好。

(2)为了鉴定纯化后的融合蛋白，我们进行了SDS分析。在12%的SDS凝胶上，融合蛋白在约50kDa处出现单一的条带，与预测的分子量相符。此外，我们还进行了Westernblotting分析，使用OpcA和NHBA特异性抗体进行检测。结果显示，纯化后的融合蛋白在预期分子量处出现特异性条带，与抗体呈阳性反应，进一步证实了融合蛋白的正确纯化。

(3)为了评估纯化后的融合蛋白的生物活性，我们进行了体外活性实验。通过