CN114836526B 一种靶向测序方法及试剂盒 （伯科生物科技有限公司）.docxVIP

(19)国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN114836526B(45)授权公告日2025.01.10

(21)申请号202210512545.5

(22)申请日2020.08.31

(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号CN114836526A

(43)申请公布日2022.08.02

(62)分案原申请数据

202010895989.22020.08.31

(73)专利权人伯科生物科技有限公司

地址214000江苏省无锡市锡山区安镇街

道丹山路78号锡东创融大厦D座5层

(72)发明人韩营民陈文浩卢亚明

(74)专利代理机构北京正元瑞驰知识产权代理事务所(普通合伙)16090

(51)Int.CI.

C12Q1/6874(2018.01)

(56)对比文件

CN105112499A,2015.12.02

CN105779439A,2016.07.20审查员李佳栋

专利代理师吴琼

权利要求书1页说明书13页附图1页

(54)发明名称

一种靶向测序方法及试剂盒

传统方法杂交反应液文库

传统方法

杂交反应液

文库

封闭试剂

本发明

杂交反应液

文库封闭试剂

探针

95℃0.5min

SSCDenhardts

SSC

DenhardtsBuffer

SodiumpyrophosphateSDS

EDTA

BetaineTMACFormamideDextranSulfate95℃10min文库变性杂交清洗后磁珠[(带清洗液)探针加入探

Betaine

TMACFormamide

DextranSulfate

95℃10min

文库变性

杂交

清洗后磁珠[(带清洗液)

探针加入探针

≥16h

30min

清洗后磁珠

(奔清洗液)

探针富集45min

探针富集

清洗

CN114836526

CN114836526B

总时间

≈1h

CN114836526B权利要求书1/1页

2

1.用于使探针与文库快速杂交的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用为用于非疾病诊断目的的使探针与文库快速杂交的方法，所述试剂盒包括如下组分：

组分1:杂交缓冲液，所述杂交缓冲液包括柠檬酸钠缓冲液、0.8-1.2M甜菜碱、0.8-1.2M四甲基氯化铵、4-6%重量/体积比的硫酸葡聚糖、18-44体积%的甲酰胺；

组分2:磁珠清洗缓冲液，所述磁珠清洗缓冲液组分包括3MNaCl、10mMTris-HClpH7.5、1mMEDTA和0.1%Tween-20;

组分3:清洗液S:1XSSC、0.1%Tween-20;

组分4:清洗液I:1XSSC、0.1%十二烷基磺酸钠；

组分5:清洗液II:0.5XSSC;

组分6:清洗液III:0.2XSSC;

所述方法包括以下步骤：

(1)使探针与文库在杂交缓冲液中接触，其中，使探针提前加入杂交缓冲液，而不是在文库变性后加入杂交缓冲液，所述文库与所述探针的变性温度为92-98℃,变性时间为30秒至2分钟，所述探针与所述文库在杂交缓冲液中杂交结合的时间为0.5-4小时；

(2)在探针与文库结合形成复合体后，利用经磁珠清洗缓冲液清洗并活化的磁珠经链霉亲和素捕获复合体，且在清洗后，链霉亲和素磁珠仍然保持在磁珠清洗缓冲液中，而无需弃掉磁珠清洗缓冲液；

(3)利用清洗液对与链霉亲和素结合的复合体进行清洗；

(4)利用PCR反应富集与探针结合的目标文库，然后纯化，随后进行高通量测序。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述探针为5生物素修饰的单链DNA,其长度为110-130nt。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括依次以下步骤：

(a)将预文库、接头阻断剂和探针混合，然后蒸干，所述预文库包括适用于MGI测序仪、Illumina测序仪、Life测序仪的预文库；

(b)向步骤(a)产物中加入杂交缓冲液，混匀并在室温孵育5分钟，随后95℃变性2分钟，65℃孵育30分钟；

(c)杂交完成后，探针与链霉亲和素磁珠结合15分钟，所述链霉亲和素磁珠经磁珠清洗缓冲液清洗两遍，并存在于50μL磁珠清洗缓冲液中；

(d)在65℃条件下，使用65℃的清洗液I清洗步骤(c)的链霉亲和素磁珠