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抗氧化自由基实验操作步骤

一、实验概述

在探讨物质抗氧化活性的诸多方法中，基于自由基清除能力的测定因其操作相对简便、灵敏度较高而被广泛应用。DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除法便是其中经典的一种。该方法通过检测受试样品对稳定的DPPH自由基的清除效果，来评价其体外抗氧化能力。本文将详细阐述DPPH自由基清除实验的标准操作流程，以期为相关研究提供参考。

二、实验原理

DPPH自由基在有机溶剂中呈现稳定的深紫色，其乙醇溶液在特定波长（通常为517nm）下有强吸收峰。当存在抗氧化物质时，由于抗氧化物质提供的氢原子能够与DPPH自由基结合，使其配对形成稳定的DPPH-H分子，溶液颜色会由深紫色逐渐变浅，直至变为黄色。颜色变化的程度与抗氧化物质的浓度及其清除能力呈正相关。通过测定反应前后溶液在特定波长下吸光度的变化，即可计算出受试样品对DPPH自由基的清除率，进而评价其抗氧化活性。

三、主要试剂与仪器

（一）试剂

1.DPPH试剂：纯度应符合实验要求，作为自由基来源。

2.无水乙醇（或甲醇）：分析纯，用于溶解DPPH及配制样品溶液。

3.受试样品：可为植物提取物、化合物纯品、食品或保健品等。若为固体样品，需用合适溶剂（通常为乙醇或样品提取溶剂）配制成一定浓度的溶液；若为液体样品，可适当稀释后直接测定或经预处理后测定。

4.阳性对照（可选）：如维生素C（Vc）、Trolox等已知具有强抗氧化活性的物质，用于方法验证和结果比较。

（二）仪器

1.紫外可见分光光度计：用于测定溶液吸光度，需配备比色皿。

2.分析天平：精度0.1mg，用于精确称量试剂。

3.容量瓶（多种规格）：用于配制标准溶液和样品溶液。

4.移液管或移液器（配套吸头）：用于准确移取溶液。

5.烧杯、玻璃棒、滴管等常规玻璃仪器。

6.超声波清洗仪（可选）：用于辅助样品溶解。

7.恒温水浴锅或incubator：用于控制反应温度（若实验要求恒温）。

8.涡旋混合仪：用于混匀溶液。

四、实验操作步骤

（一）DPPH溶液的配制

1.DPPH储备液的配制：精确称取适量DPPH粉末，置于烧杯中，用无水乙醇（或甲醇）作为溶剂，在避光条件下搅拌或超声助溶，直至完全溶解。将溶解后的溶液转移至相应体积的棕色容量瓶中，用无水乙醇（或甲醇）定容至刻度，摇匀。此储备液浓度通常为0.1mmol/L左右（具体浓度可根据预实验结果调整，以其在517nm处的吸光度值在1.0左右为宜）。配好的DPPH储备液应置于冰箱中4℃避光保存，一般可稳定数日，使用前需恢复至室温并再次混匀。

2.DPPH工作液的配制（若需要）：根据储备液浓度和实验需求，用无水乙醇（或甲醇）将DPPH储备液稀释至所需浓度的工作液。工作液应现用现配或在临用前配制，以保证其稳定性。

（二）样品溶液的制备

1.样品预处理：根据样品性质进行适当预处理。对于固体样品（如植物干粉），通常需用合适的溶剂（如水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯等）进行提取，得到提取液后离心或过滤，取上清液或滤液作为待测样品液。对于液体样品，可视情况直接测定或进行适当稀释。对于不易溶解的样品，可考虑加热、超声或调整溶剂等方法辅助溶解。

2.样品溶液的配制：将预处理后的样品母液用无水乙醇（或与DPPH溶液相同的溶剂）稀释成一系列不同浓度的样品溶液，一般至少设置3-5个浓度梯度，以考察剂量效应关系。同时，制备一份不含样品的空白溶剂（即用于溶解样品的溶剂）作为样品空白。

（三）阳性对照溶液的配制（可选）

精确称取适量阳性对照品（如Vc），用无水乙醇（或甲醇）溶解并稀释成一系列浓度梯度的溶液，浓度范围应覆盖其能产生明显清除效果的区间。

（四）测定步骤

1.设置反应体系：在一系列干净的比色管或离心管中，按以下顺序和比例加入试剂：

*样品组：加入一定体积的不同浓度的样品溶液，再加入等体积（或特定体积，根据实验设计）的DPPH工作液。例如，可加入1.0mL样品溶液和1.0mLDPPH工作液。

*样品空白组：加入与样品组相同体积的样品溶液，再加入等体积的无水乙醇（或甲醇）代替DPPH工作液。此组用于消除样品本身颜色对吸光度测定的干扰。

*DPPH对照组（空白对照组）：加入与样品溶液相同体积的无水乙醇（或甲醇），再加入等体积的DPPH工作液。此组作为DPPH自由基的初始状态。

*阳性对照组（若有）：操作同样品组，将样品溶液替换为阳性对照溶液。

2.混匀与反应：将各管溶液充分混匀（可使用涡旋混合仪），然后在室温（或特定温度，如37℃）下避光静置反应一定时间（通常为30min至1h，具体时间需根据预实验确定，确保反应达到稳定）。

3.吸光度测定：反应结束后，将各管反应液转移至比色皿中，以无