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山东省禽源大肠杆菌中质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因型的检测

摘要

为研究近年来山东省禽源致病性大肠杆菌中质粒介导喹诺酮类药物耐药（plasmid-mediatedquinoloneresistance，PMQR）基因的基因型分布，及其对喹诺酮类抗生素的耐药性的影响，分别采用针对qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB与qepA8个耐药基因的通用引物，对93株2012-2013年分离自山东省的禽源大肠杆菌进行PCR检测，并对其进行了5种喹诺酮类药物的药敏试验。结果表明山东省禽源大肠杆菌对5种喹诺酮类抗生素均产生了较高耐药性（50.54%-86.30%）；PMQR基因携带率达到60.21%（56/93），其中26.88%（25/93）的菌株携带2种PMQR基因，1.07%（1/93）的菌株携带3种PMQR基因；qnrA、qnrB、qnrC、qnrD与qepA基因未被检测到，qnrS、oqxA和oqxB基因在山东省禽源致病性大肠杆菌中分布较为广泛，其检出率依次为22.58%（21/93）、40.86%（38/93）和24.73%（23/93）。

关键词

禽源大肠杆菌；质粒介导喹诺酮类药物耐药基因；PCR；药敏试验

一、引言

喹诺酮类（Quinolones）药物是人工合成的含4-喹诺酮基本结构，对细菌DNA螺旋酶具有选择性抑制作用的抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、口服吸收良好、与其他常用抗菌药无交叉耐药等优点，在人医和兽医临床得到广泛应用。随着喹诺酮类药物的广泛应用，细菌对其耐药现象也日益严重。

细菌对喹诺酮类药物的耐药机制主要有两种：一是染色体介导的靶位基因突变，导致细菌DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ结构改变，使喹诺酮类药物与靶位的亲和力下降；二是质粒介导的耐药机制，即通过质粒携带耐药基因，使细菌产生对喹诺酮类药物的耐药性。质粒介导的喹诺酮类药物耐药（PMQR）基因的发现，使人们对细菌喹诺酮类耐药机制有了新的认识。PMQR基因不仅能使细菌对喹诺酮类药物产生耐药性，还能促进染色体介导的耐药突变的选择，加快耐药菌株的产生和传播。

大肠杆菌（Escherichiacoli）是一种重要的人畜共患病原菌，可引起禽类的多种疾病，如败血症、腹膜炎、输卵管炎等，给养禽业造成巨大经济损失。近年来，禽源大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药问题日益突出，严重影响了养禽业的健康发展和公共卫生安全。因此，了解禽源大肠杆菌中PMQR基因的分布情况，对于合理使用喹诺酮类药物、有效控制禽源大肠杆菌感染具有重要意义。本研究旨在对山东省禽源大肠杆菌中质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因型进行检测，为临床合理用药和防控禽源大肠杆菌感染提供科学依据。

二、材料与方法

2.1试验材料

2.1.1菌株来源

93株禽源大肠杆菌菌株于2012-2013年分离自山东省不同地区的鸡、鸭、鹅等禽类养殖场，菌株分离后经形态学观察、生化试验及16SrRNA基因序列分析鉴定为大肠杆菌。

2.1.2主要试剂和仪器

TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker等购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；药敏纸片（萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星）购自杭州微生物试剂有限公司。PCR扩增仪（Bio-Rad公司）、凝胶成像系统（UVP公司）、恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）等。

2.2试验方法

2.2.1细菌基因组DNA的提取

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书的方法，提取93株禽源大肠杆菌的基因组DNA，用超微量核酸蛋白测定仪测定DNA浓度和纯度，将DNA浓度调整至50ng/μL，-20℃保存备用。

2.2.2PMQR基因的PCR检测

根据GenBank中已公布的qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB与qepA基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，引物序列及扩增片段大小见表1。PCR反应体系为25μL：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH?O17.3μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火温度（见表1）退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电