新版酶免疫测试EIA技术.pptx

酶免疫分析技术（enzymeimmunoassay,EIA）是继荧光免疫技术和放射免疫技术之后建立一个非放射性免疫技术，是将抗原抗体反应高度特异性和酶高效催化作用相结合，发展建立一个非放射性标识免疫性标识分析方法。酶免疫分析系统则属于开放式，符合标准各种品牌ELISA试剂盒均可应用，且有灵敏度高、特异性强、酶免疫试剂性质比较稳定、操作方法简便、快速、无放射性污染以及应用范围广等很多优点。

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酶免疫分析技术

非均相酶免疫分析

均相酶免疫分析

非均相液相酶免疫分析

非均相固相酶免疫分析

以聚苯乙烯制品作为载体酶联免疫吸附试验---ELISA

一、酶免疫测试（EIA）技术分类

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二、ELISA技术方法与原理

（1）ELISA特点：在固相表面组装免疫活性物质形成免疫吸附剂；酶标识免疫活性物质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程；灵敏度特异性相对较高。

（2）ELISA不足：只能检测到ng水平，精密度差（批内CV15-20%）；线性范围窄（一个数量级）。

（3）依据检测目标和操作步骤不一样有三种基本方法：双抗体（原）夹心法；间接法；竞争法

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ELISA测试原理

1）将链霉亲合素包被聚苯乙烯塑料试管安置固定。

2）将生物素标识特异性抗体和待测抗原加入链霉亲合素包被小管内，经温育，生物素和亲和素发生连接，待测抗原和特异性抗体发生结合，形成固相包被亲合素-生物素-特异性抗体-待测抗原复合物，然后进行洗涤，除去未结合抗原和生物素标识抗体。

3）加入辣根过氧化物酶(HRP)标识特异性抗体(酶标抗体)，经温育形成固相包被链酶亲合素-生物素-特异性抗体-待测抗原-酶标抗体复合物，再次进行洗涤，除去多出酶标抗体。

4）加入底物ABTS和H2O2，经温育，ABTS在辣根过氧化物酶作用下显色，然后经波长450nm光度计测定取得A值，从标准曲线上计算出待测抗原含量。

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三、自动化酶标仪基本工作原理

光源光路微孔板

触摸屏电源

单

A/D转换程控放大器多路开关光电检测

显示器

片

打印机

步进电机驱动步进电机送样机构

电源

机

图2工作原理方框图

电源

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四、ELISA操作步

（1）试剂准备

（2）加样

（3）保温

使用恒温水箱

使用保温箱

（4）洗涤

（5）比色

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五、ELISA质量控制

（一）测试前标本采集和保留

（1）可作标本广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可。

（2）标本采集时应尽可能防止溶血，不然造成假阳性；长菌标本一样道理易产生假阳性。

（3）抗凝不完全标本因纤维蛋白元干扰而造成假阳性，提议尽可能不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。

（4）标本保留：血清置4℃冰箱5天内完成测试；一周以上则要-20℃冰冻保留，融解时应上下颠倒充分混匀。

（5）ELISA灵敏度1ng/ml水平上,标本间污染要尽可能防止，尤其不应与生化试验用同一管标本，最起码应先做免疫后做生化。

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（二）仪器质控

（1）移液器：ELISA加样量小（5-100ｕl），其准确性直接影响试验结果，利用称重法检验，普通应在±10%以内；

（2）水浴箱：经常检验水浴箱温度计所表示温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃误差；

（3）洗板机：每个厂家设置洗板后残留液有各自要求普通不超出2ul，人工扣板时，垫纸不湿，定时检验管孔是否堵塞；

（4）酶标仪：经常维护其光学部分，预防滤光片霉变，定时检测校正，使其保持良好工作性能。

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（三）分析中质控

（1）加样

（2）温育

（3）洗涤

（4）显色

（5）酶标仪判读结果

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六、ELISA操作注意事项

（1）测试之前，冰箱内试剂一定要复温（至室温），并检验是否已经变质，同时用双蒸水稀释浓缩洗涤液和稀释液，若用不合格蒸馏水则可使空白值增高。

（2）微量加液器应注意保养并定时校正，不然结果误差较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物