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细胞培养与实验技术标准操作手册

一、引言

细胞培养技术作为现代生命科学研究的基石，其核心在于模拟体内生理环境，使细胞在体外得以存活、生长和繁殖，从而为细胞生物学、分子生物学、药理学、毒理学等众多领域的研究提供稳定的实验模型。规范的操作是保证细胞培养成功率、实验结果可靠性与可重复性的前提，同时也是确保实验室生物安全的关键。本手册旨在提供一套系统、严谨且实用的细胞培养与相关实验技术标准操作流程，适用于基础研究实验室的日常工作。使用者应在充分理解各操作环节原理的基础上，严格遵守本手册规定，并结合具体实验需求与细胞特性进行灵活调整。

二、实验室基本要求与安全规范

2.1实验室环境

细胞培养实验室应划分明确的功能区域，至少包括更衣区、缓冲间、操作区（如超净工作台区域）、培养区（如CO?培养箱放置区）、试剂准备区、灭菌区及废弃物处理区。各区域应保持清洁、干燥、通风良好，并张贴明确标识。操作区需定期进行清洁消毒，地面、墙面应采用耐清洗、耐腐蚀的材料。

2.2个人防护装备（PPE）

所有进入细胞培养实验室的人员必须严格遵守个人防护规定，穿戴合适的PPE，包括：

实验服：应选择长袖、束口款式，专用且定期清洗消毒。

手套：操作过程中必须佩戴一次性无菌手套，接触不同细胞系或可能污染的物品后应及时更换。

护目镜/面罩：在进行可能产生气溶胶或液体飞溅的操作（如离心管开盖、混匀）时佩戴。

口罩：建议在超净工作台内操作时佩戴，以减少微生物污染风险。

发帽与鞋套：根据实验室级别和具体要求选用，以维持操作环境洁净。

2.3生物安全

严格遵守实验室生物安全等级对应的操作规程，特别是对于使用具有潜在生物危害的细胞系（如人类肿瘤细胞、病毒感染细胞）时，需在相应级别的生物安全柜内进行操作。

实验废弃物（包括废弃培养基、污染耗材、细胞残渣等）必须分类收集，并按照规定程序进行无害化处理，不得随意丢弃。

实验结束后，操作人员应彻底洗手消毒，实验台面及相关仪器设备需进行清洁和消毒。

禁止在实验室内饮食、吸烟、化妆或进行其他与实验无关的活动。

三、细胞培养常用试剂与耗材准备

3.1主要试剂及其配制与储存

细胞培养基：根据细胞类型选择合适的商品化基础培养基，如需添加血清（如胎牛血清FBS），应选择合格批次并按推荐比例添加。部分细胞培养还需添加特定的生长因子、抗生素（如青霉素-链霉素双抗，用于预防细菌污染，但长期使用可能影响细胞状态，需酌情使用）等。培养基配制应在无菌条件下进行，充分混匀后，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装后于4℃避光储存，储存时间不宜过长，具体参照试剂说明书。

平衡盐溶液（BSS）：如PBS、HBSS等，用于细胞洗涤、稀释等。可购买商品化溶液或自行配制，经高压灭菌或过滤除菌后储存。

消化液：常用胰蛋白酶-EDTA溶液，用于贴壁细胞的消化传代。使用前需预热至37℃，并注意其浓度和作用时间，避免过度消化对细胞造成损伤。应分装后于-20℃储存，避免反复冻融。

冻存液：通常由培养基、血清和二甲亚砜（DMSO）或甘油组成，血清比例可适当提高（如70%培养基+20%血清+10%DMSO）。DMSO需为细胞培养级，使用前应确认其对所培养细胞的毒性。冻存液应现用现配，或分装后-20℃储存。

3.2常用耗材与仪器

耗材：细胞培养瓶、培养皿、多孔培养板、离心管、移液管、吸管、过滤器、冻存管等。所有与细胞直接接触的耗材必须为无菌、无热源产品，优先选择一次性使用产品。

仪器：超净工作台、CO?培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、离心机、恒温水浴锅、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、液氮罐、高压灭菌器、pH计、移液器等。仪器应定期维护、校准和清洁消毒，确保其正常运行和实验环境的无菌性。

3.3试剂与耗材的质量控制

建立完善的试剂耗材采购、验收和入库制度。新批次试剂（尤其是血清、培养基）在大规模使用前，应进行小范围细胞培养测试，评估其对细胞生长、形态及相关功能的影响。

耗材开封前检查包装是否完好、有无破损或污染迹象，确认灭菌有效期。

四、细胞培养基本操作技术

4.1细胞复苏

细胞复苏是将冻存的细胞从低温环境中恢复至常温并重新培养的过程，操作的关键在于快速解冻以减少冰晶对细胞的损伤。

1.准备工作：提前将所需培养基预热至37℃。在超净工作台内，用75%酒精擦拭冻存管外壁，去除可能的污染。

2.快速解冻：将冻存管立即放入37℃恒温水浴锅中，轻轻晃动，使管内冻存液迅速融化（通常1-2分钟）。注意水面不要超过管盖，避免污染。

3.细胞转移与洗涤：待冻存液完全融化后，用移液器将细胞悬液缓慢转移至含有适量预热培养基的离心管中，轻柔混匀，以稀释DMSO。

4.离心沉淀：____rpm离心5-8分钟，弃上清。

5.重悬与接种：向离心管中加入适量预热的新鲜培养基，用移液器轻轻吹打细胞沉淀