CN112891633A 一种基于生物3d打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法 （华中科技大学同济医学院附属协和医院）.docxVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN112891633A

(43)申请公布日2021.06.04

(21)申请号202110111703.1

(22)申请日2021.01.27

(71)申请人华中科技大学同济医学院附属协和

医院

地址430022湖北省武汉市江汉区解放大

道1277号

(72)发明人牟珊汪振星孙家明周莹芊

郭亚琪锁丽涛陈雳风周牧冉

刘绍恺罗超曾宇阳方慧敏慈海侯金飞谢昕芳孙谛

张郭刘剑王冰倩倪若飘

王斌陈佳龙李志鹏姜文彬揭君津赵阳

(74)专利代理机构武汉楚天专利事务所42113代理人邹舟

(51)Int.CI.

A61L27/40(2006.01)

A61L27/02(2006.01)

A61L27/22(2006.01)

A61L27/20(2006.01)

A61L27/18(2006.01)

A61L27/38(2006.01)

A61L27/50(2006.01)B33Y70/10(2020.01)B33Y80/00(2015.01)C12N5/071(2010.01)

C12N5/077(2010.01)

C12N5/0775(2010.01)

权利要求书2页说明书4页附图3页

(54)发明名称

一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法

(57)摘要

CN112891633A本发明提供一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，利用同轴式生物3D打印，以氯化钙溶液作为内层，将甲基丙烯酸酐化明胶，海藻酸钠，聚乙二醇二丙烯酸酯及血管平滑肌细胞混合作为外层生物墨水，打印出的支架通过氯化钙和蓝外光照进行彻底交联，最后形成三位一体化可灌流支架，从而建立血运。在支架内灌注血管内皮细胞，模拟血管细胞成分。在三层支架上分别接种成纤维细胞，脂肪间充质干细胞，骨骼肌成肌细胞，分别加入成纤维细胞培养基，成脂诱导培养基及成肌细胞培养基并放置于反应器中进行培养，将三层支架进行折叠，通过鼠尾胶原进行粘接，形成堆叠式支架。本发明实

CN112891633A

血管平滑肌细胞

血管平滑肌细胞(VSMC)

+水凝胶

成纤维细胞(真皮)指肪组胞(皮下组织)骨他机细抱(肌肉)

折叠组装

皮瓣模拟支架

CN112891633A权利要求书1/2页

2

1.一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)以氯化钙溶液作为内层，将甲基丙烯酸酐化明胶，海藻酸钠，聚乙二醇二丙烯酸酯及血管平滑肌细胞混合作为外层生物墨水，设计串联的三个支架，利用生物3D打印机进行同轴打印；

(2)将步骤(1)打印出的支架通过氯化钙和蓝光光照进行彻底交联，最后形成三位一体化可灌流支架，从而建立血运，在支架内灌注血管内皮细胞，模拟血管细胞成分；

(3)在三个支架上分别接种成纤维细胞，脂肪间充质干细胞，骨骼肌成肌细胞，并放置于生物反应器的反应仓中进行分隔独立培养及一体化灌注；

(4)向步骤(3)中三个反应仓中分别加入成纤维细胞培养基，成脂诱导培养基及成肌细胞培养基培养7-14天，将三层支架进行折叠，通过鼠尾胶原进行粘接，形成堆叠式支架，继续培养7-21天，以促进三层融合，得到立体血管化肌皮瓣。

2.根据权利要求1所述的基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于：所述步骤(1)中外层生物墨水的制备步骤如下：按照质量体积比将5%-8%甲基丙烯酰化明胶，1-3%海藻酸钠，10-15%聚乙二醇二丙烯酸酯和0.05-0.1%光引发剂LAP溶解在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，再加入血管平滑肌细胞，使细胞浓度为5*10?-10?个/mL。

3.根据权利要求2所述的基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于：所述外层生物墨水制备好后储存在37℃直到使用。

4.根据权利要求1所述的基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于：所述步骤(1)中CaCl?溶液的浓度为25-75mM,采用双通道同轴系统打印三维管状结构，内层为CaCl?溶液，使用20mL注射器，挤出速度为0.1mm-0.2/min,外层为生物墨水，使用