原代细胞分离通用步骤全解析——从样本处理到质控的科研级技术指南.docxVIP

原代细胞分离通用步骤全解析——从样本处理到质控的科研级技术指南

原代细胞分离是从活体组织中获取未传代、保留体内生物学特性的细胞的核心技术，广泛应用于肿瘤机制研究、干细胞治疗研发、药物敏感性筛选等领域。与传代细胞株相比，原代细胞更接近体内状态，但分离过程对操作标准化要求极高——任何步骤的偏差都可能导致细胞活力下降、纯度不足或功能丧失。

一、样本采集与预处理：实验成功的“源头防线”

原代细胞的质量首先取决于样本的新鲜度与无菌性。

-样本来源：常见为动物组织（如小鼠肝脏、大鼠肌肉）或人体活检/手术标本（需符合伦理规范）；

-操作要点：

1.无菌操作：采集工具（剪刀、镊子）需高压灭菌，动物需经75%乙醇体表消毒，人体标本需用含抗生素（青霉素+链霉素）的PBS冲洗；

2.快速处理：样本采集后30分钟内放入预冷的无血清培养基或PBS中，避免细胞因缺氧、温度变化受损；

3.组织修剪：去除样本中的脂肪、坏死组织及结缔组织（如血管、筋膜），保留目标组织（如肝脏的实质部分、肿瘤的核心组织）。

二、组织解离：从“组织块”到“单细胞悬液”的关键一步

解离的核心是破坏细胞间的连接结构，常用机械法与酶解法组合：

-机械法：适合结缔组织少的组织，通过剪碎、研磨或挤压分散细胞；优点是快速，缺点是易造成细胞损伤，适合对机械力耐受的细胞；

-酶解法：更常用的方法，利用蛋白酶或螯合剂分解细胞间成分：

-胰蛋白酶：分解细胞间的糖蛋白与粘连蛋白，适合上皮组织，浓度0.25%-0.5%，37℃孵育15-30分钟；

-胶原酶：分解胶原纤维，适合致密组织，浓度0.1%-0.3%，37℃孵育30-60分钟；

-EDTA：螯合Ca2?/Mg2?，破坏细胞间的钙黏蛋白连接，常与胰蛋白酶联合使用；

-终止反应：酶解后立即加入含胎牛血清（FBS）的培养基，中和酶活性，避免过度消化。

三、细胞过滤与离心：去除杂质，富集目标细胞

解离后的细胞悬液含大量组织碎片与死细胞，需通过过滤+离心纯化：

-过滤：用70-100μm细胞滤网过滤，去除直径大于细胞的组织碎片；

-离心：将滤液以1000-1500rpm离心5-10分钟，收集细胞沉淀；

-洗涤：用无血清培养基重悬沉淀，再次离心，去除残留的酶与碎片。

四、细胞纯化：从“混合悬液”到“高纯度细胞”

即使经过过滤离心，细胞悬液仍可能含杂细胞，需进一步纯化：

-密度梯度离心：利用细胞密度差异分离，常用Percoll或Ficoll梯度液；

-免疫磁珠法：针对目标细胞的特异性标志物，用偶联抗体的磁珠吸附目标细胞，通过磁场分离，纯度可达95%以上；

-贴壁筛选法：利用细胞贴壁能力差异——成纤维细胞贴壁快，而上皮细胞贴壁慢，可通过“差速贴壁”去除成纤维细胞。

五、细胞计数与活力检测：量化评估细胞质量

计数：用台盼蓝染色，通过血球计数板计算细胞浓度；

活力检测：活细胞比例需≥90%；

注意：计数时避免细胞聚集，确保结果准确。

六、接种与培养：模拟“体内微环境”的关键

培养基选择：根据细胞类型优化配方——上皮细胞用KeratinocyteSFM，间充质干细胞用α-MEM，神经细胞用Neurobasal培养基；

接种密度：根据细胞增殖能力调整，如成纤维细胞为1×10?cells/cm2，干细胞为5×10?cells/cm2；密度过低会导致细胞生长缓慢，过高则易引起接触抑制；

培养条件：放入CO?培养箱，24小时后换液，后续每2-3天换液一次。

七、质控与鉴定：确保细胞“身份”与“功能”的一致性

原代细胞需通过形态学+标志物+功能三重鉴定，确保未被污染或分化：

1.形态学鉴定：倒置显微镜下观察——上皮细胞呈多边形、铺路石样排列，成纤维细胞呈长梭形，神经细胞有明显轴突；

2.标志物检测：用免疫荧光或流式细胞术验证特异性标志物（如内皮细胞表达CD31、间充质干细胞表达CD73/CD90/CD105）；

3.功能验证：针对细胞特性设计实验——干细胞需验证分化能力（诱导为骨/脂肪/软骨细胞），肿瘤细胞需验证增殖（CCK-8实验）与侵袭能力（Transwell实验）。

实验常见误区与解决

细胞活力低：多因样本处理延迟、酶浓度过高或离心速度过快（＞2000rpm），需缩短样本运输时间、降低酶浓度（如从0.5%胰酶调整为0.25%）、降低离心速度；

细胞污染：多因样本未消毒彻底或试剂污染，需用含双抗的培养基冲洗样本，试剂需经0.22μm滤膜过滤；

细胞生长慢：可能是培养基配方不当（如血清质量差）或接种密度过低，需更换优质胎牛血清（如尚恩生物的无支原体血清），调整接种密度。

选择可靠供应商，降低实验风险

原代细胞分离的每一步都依赖稳定的试剂与标准化的质控。尚恩生物作为武汉光谷生物城的国家高新技术企业，专注细胞及生物试剂研发多年，构建了