第四章基因工程的主要技术及其原理.ppt

原理

;凝胶电泳;猪基因组DNA及PCR产物

电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，

微波炉，紫外透射检测仪等。

琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液：Ⅰ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液;Ⅱ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液

;相关知识：

①影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素、迁移速率由DNA的分子大小、琼脂糖浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、碱基组成与温度、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等许多参数确定。;实验步骤;;结果与分析;结果与分析;琼脂糖凝胶电泳装置;实验步骤;;;;;;;现在是17页\一共有145页\编辑于星期四;现在是18页\一共有145页\编辑于星期四;电泳结果分析;脉冲电场（PFGE）解决大分子DNA电泳问题;现在是21页\一共有145页\编辑于星期四;Blotting;定义：;(1)Southern印迹杂交法;SouthernBlotPartI:Gelelectrophoresisfollowedbytransfertoamembrane;SouthernBlotPartII:HgybridizationofDNAonmembranetospecificprobe;现在是27页\一共有145页\编辑于星期四;DNAstainedwithethidiumbromide;现在是29页\一共有145页\编辑于星期四;现在是30页\一共有145页\编辑于星期四;NorthernBlotprobedwithb-globin;核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来检验核酸的缺失、插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中的关系，其主要应用如下图所示：;核酸杂交及其应用示意图

Ⅰ.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链

Ⅱ.突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线框内是已缺失的部分；D是显示从天然DNA链鼓出小泡

Ⅲ.粗线代表探针，粗线上的X表示放射性标记;在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称探针技术(Probe)。;Westernblot实验技术;Makingaprobe;Ashortsequenceofaproteinisusedtodesignasetof

oligonucleotidesforuseasaprobetorecoverthegenethatencoded

theprotein.Oneoftheprobesequencewillbeaperfectmatchforthe

gene;WesternBlot基本原理;WesternBlot一般流程;通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

水溶液提取法

针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液

对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。

细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0

有机溶剂提取法

对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、

丙酮和丁醇等。

通过层析或电洗脱法制备目的蛋白

;蛋白样品的定量;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺??

SDS

配胶的Tris缓冲液

TEMED

过硫酸铵(时间)

Tris-甘氨酸电泳缓冲液

;凝胶浓度与蛋白分离范围;现在是45页\一共有145页\编辑于星期四;转膜;转膜;现在是48页\一共有145页\编辑于星期四;转膜后检测;封闭;一抗、二抗孵育;二抗与底物反应显色;WesternBlot常见问题分析;SDS电泳;条带比正常的窄？

“微笑”或“倒微笑”条带？;转膜及抗体检测;背景太高;Westernblotissimilarinconcepttonorthern,exceptusepolyacrylamideandrunoutproteins;免疫化学检测法;Usingantibodiestodetectaclone;重组体的转化;利用生物方法导入、转染

1.细胞噬菌体DNA的转染

2.动物病毒DNA的转染

3.植物病毒D