基于组学探究Ganoderma sinense S4的降解偏好性及灵芝酸合成机制.pdfVIP

摘要

近年灵芝作为高等药用真菌原料的需求量越来越大，灵芝酸（Ganodericacids，

GAs）是灵芝药用功效的核心成分之一。灵芝传统培育方式中存在灵芝孢子、子实体

生长周期长,生长环境要求高以及灵芝酸相对含量低等问题；目前行业热点多在于在

液态发酵中大规模较低成本地获得灵芝产物。但目前灵芝液态发酵存在如下关键问题：

缺乏系统性的碳氮源底物比较偏好性分析，以及底物配比与灵芝酸产量关联不明晰，

难以精准指导发酵基质优化。此外挖掘农业纤维素类生物质资源（秸秆、木粉、麸皮

等）作为发酵工业的纯碳氮源替代品，有助于解决资源紧缺、降本增效等问题。因此,

本研究本着干湿结合的实验策略。通过生物信息学、蛋白质组学等技术，分析了解

菌株降解偏好性；检测灵芝液态发酵过程中的生理生化指标，以此对灵芝生长的碳氮

源底物进行筛选评估；并进一步考察在不同碳氮源复配底物条件发酵诱导下灵芝酸合

HMGRLSSCYP512W2

成关键酶、、的转录水平，为液态培养生物量与灵芝酸化合物

高产，以及农业纤维素类生物质资源循环利用提供参考。主要得出以下结论：

（1）根据基因组分析发现，GanodermasinenseS4编码了283个生物质降解相关

酶组分、包含纤维素酶、半维素酶等9种底物类型，具有降解纤维素链的内切与外切

纤维素酶组分，且大多数编码的CAZymes基因为基于木质纤维素生物量的

GanodermasinenseS4腐生生活方式提供了遗传基础。后续底物降解偏好性实验验证，

至培养结束的96h节点，木聚糖与杨木粉诱导的内切葡聚糖酶活性在135～150U/mL

之间，显著高于其他四种底物；而几丁质与淀粉诱导的内切葡聚糖酶活性均低于20

U/mL。菌株在纤维素类底物上具有明显水解能力，在淀粉与几丁质底物上生长则缺

乏。从胞外蛋白条带分泌时间和分泌量来看，木粉和木聚糖诱导分泌纤维素酶的能力

最强，多产生35-100KDa的多条蛋白条带，淀粉与几丁质底物的诱导能力最弱无明

显蛋白条带。对应基因组分析结果，推测木质纤维素类底物如木粉、木质材料提取木

聚糖等，能够促进灵芝菌株的快速生长。

（2）根据基因组分析发现，菌株携带信号肽具有分泌至胞外潜力的蛋白酶共54

个。S10、S53、A1家族丝氨酸羧肽酶编码基因序列中12、8、6条具有信号肽，是蛋

MMS

白质降解系统中重要的组成部分；所编码的26与35家族金属内肽酶、8家族三

肽基肽酶同样是蛋白降解系统的主要功能酶系。后续底物降解偏好性实验验证，菌体

在明胶与脱脂奶粉上产酶效率低，无明显生物量积累。以酵母提取物、胰蛋白胨和水

I

溶性玉米蛋白粉为氮源时能诱导出较多的蛋白条带。单一氮源底物所诱导的总蛋白条

带数量与浓度整体明显逊于单一碳源诱导总蛋白条带数量与浓度，且单一氮源诱导分

泌时间滞后于单一碳源，在培养中后期（48-72h）才出现明显条带，而非早期（24h

内）。对应基因组分析结果，菌株对于环境中大豆蛋白等完整球蛋白虽然可以降解，

但利用潜能一般；对于氮源利用潜力弱，选择上敏感度低。

（3）整体实验培养第6天结束时，HMGR作为甲羟戊酸通路的限速酶，其转录

水平在木聚糖/玉米蛋白粉复合处理组呈现显著上调；与对照组相比，木聚糖/玉米蛋

HMGR4.50±0.37LSS

白粉组的相对表达量达到倍。作为羊毛甾醇骨架合成的关键催

化酶，在杨木粉/玉米蛋白粉组中表现出最显著的转录激活效应。杨木粉/玉米蛋白粉

组LSS表达量达5.12±0.43倍，而木聚糖/玉米蛋白粉为3.84±0.29倍。LSS的时序表

HMGR24-486LSS

达动力学显示其峰值较滞后小时，整体实验处理在第天酶的表

达量领先于HMGR酶。CYP512W2作为羊毛甾醇后修饰的核心氧化酶，其表达水平

在木质纤维素处理组呈现