细胞生物学研究方法：显微镜技术及其应用.pdfVIP

第二章细胞生物学研究方法

09逸仙桑叶

许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成，往往来自新技术的应用。

1590年，Z.Janssen和他的侄子共同研制了最早的光学显微镜。和列对光学

显微镜的分辨率进行了极大的改进。20世纪30年代发展起了电子显微镜。

光学和电子显微镜成像有3个基本要素：照明系统、被观察的样品、聚焦和成像的透镜

系统。它的原理是当样品被放置在光（光学显微镜）或（电子显微镜）的同路中，光

束或被改变的特征能够用肉眼观察或被显像板记录下来。光和电子都具有波的行

为，当光和电子穿过透镜到达聚焦点时，由于波的性质而成像。实际上通过透镜观察到

的样品的镜像是通过透镜波的累加或消除，即衍射的结果。波长决定被检测样品的最小

极限。焦距：透镜的平面到焦点的距离。角孔径：表示有多少光离开样品通过透镜，最

好为70度。分辨率（r）：能分辨出的相邻两个物点间最小距离的能力。分辨距离越小，分

辨率越高。一般规定：显微镜或人眼在25cm明视距离处，能清楚地分辨被检测物体细微结

构最小间隔的能力。r=0.61λ/nsinα，其中n为聚光镜和物镜之间介质的折射率。α为样

品对物镜孔径角的半角。λ为照明光源的波长。增大角孔径或缩短波长增大分辨率。分辨极

限：对可见光来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是0.2um。放大率：最终成像

的大小与原物体大小的比值。总放大率=物镜放大率×目镜放大率。

常用的光学显微镜有普通双筒显微镜：亮度较暗，优点是两眼同时观察，有较强的立体

感。荧光显微镜：紫外线为光源，使物体发出荧光（自发荧光、诱导荧光）；用于研究细胞

内物质的吸收、以及化学物质的分布及定位。相差显微镜：能观察无色、透明、活细胞

中结构。不同成分的不同部分很可能有不同的光衍射系数，相差显微镜将这种差异转变成明

与暗的差异。这种转变依靠光波的。暗视野显微镜：观察被物体反射或衍射的光线；主

要用于观察染色的或胶体粒子。观察到的是物体的轮廓，分辨不清的细微结构。

倒置显微镜：载物台在上方，可直接对培养的细胞进行观察。

光学显微镜样品包括样品的固定：杀死细胞，稳定细胞的化学成分，并且使样品硬

化以便在进一步的处理和切片时不会收到破坏。使用醛类固定液、或戊二醛固定剂。包

埋和切片：用液态的石蜡或树脂做包埋剂，切片机切割包埋块制成薄切片。染色：给细胞的

不同组分带上可区别的颜色特征。自显影：用感光胶片测定细胞内某种被性标记的

物质在细胞固定时所在位置。

电子显微镜有透射电子显微镜：让样品而成像。3部分：电子光学系统、真

空系统、电子学系统。扫描电子显微镜：利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态。扫

描透射电子显微镜：具有以上两种显微镜的功能。高压电子显微镜：与透射电子显微镜基本

相同，但电压特别高；大大减少造成畸变的可能。

电子显微镜样品的包括固定、包埋、切片、染色。负染色：只染背景；用重金属盐

进行染色。喷镀：朝向加热丝的一面被金属覆盖，背向则没有，观察室覆盖的光亮。冷冻断

裂复型和冷冻蚀刻。

间接成像技术有扫描隧道显微镜：根据量子力学中隧道效应设计。在样品与探针之间产

生隧道电流，隧道电流对距离的变化十分敏感。进行表面扫描，根据电流反应各种信息。可

用于表面结构分析、表面电子态和化学特性分析。原子力显微镜：样品可以不是导电体。X

射线衍射：通过结晶样品形成衍射样式成像。用于在原子分辨的水平上推测分子的结构。

细胞化学技术包括酶细胞化学术、免疫细胞化学术和其他的细胞化学术。酶细胞化学技

术通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。酶反应：酶作用于底物。捕捉反应：

捕捉剂与初级反应产物作用。最终产物是有色沉淀。免疫细胞化学技术利用免疫反应定位组

织或细胞中抗原成分分布。免疫荧光技术：免疫学方法和荧光标记技术结合。免疫电镜：有

免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。其他细胞化学技术有显微分光光度术：

分析生物样品细微结构中的化学成分，同时进行定位、定性和定量。显微荧光技术：利用显

微分光光度计对细胞内原有能发光的物质或对细胞内各种化学成分用荧光探针标记后进行