第二章基因工程的酶学.pptVIP

第二章基因工程的酶学;优选第二章基因工程的酶学;;第4页，共114页。;第二章基因工程的酶学基础;第6页，共114页。;第7页，共114页。;(II类)限制性内切酶;首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。;一、限制性内切酶的基本特性;（2）内切酶与识别序列的结合模式;（3）切割位点;（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）;;①连接便利;;凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。;识别位点的序列相同的限制性内切酶。;XmaI5’-C?CCGGG-3’

3’-GGGCC?C-5’

SmaI5’-CCC?GGG-3’

3’-GGG?CCC-5’;识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等;5’-?GATC----3’

3’----CTAG?-5’;二、DNA末端长度对限制酶切割的影响;在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。另外，了解末端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多克隆位点时选择酶切秩序。;;????某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。;????λ噬菌体DNA为48502bp，含12bp粘端。EcoRⅠ酶切割???噬菌体中的5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；;四、在实验室条件下进行酶切;五、酶切反应条件;缓冲液(Buffer);不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。;???EcoRⅠ若反应16小时，所需酶量为正常酶切时间的1/8，即若反应时间为16小时，则所用酶量为只切1小时的1/8。;终止酶切的方法;??EDTA可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mM；;与酶切反应条件相关的两个现象;??在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称。星号（*）活性。;;内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。;只有有限数量的酶切位点被切开。;请确定XbaI,XhoI和KpnI位点在DNA上的相对位置。;第40页，共114页。;六、影响???制性内切酶活性的因素;从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。;（1）大肠杆菌连接酶;（1）必须是两条双链DNA。;1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。;;5.3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。;连接酶反应的最佳温度是37?C。;增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。;第三节DNA聚合酶(自学);1.共同特点;DNA聚合酶;三、DNA聚合酶在基因工程中的用途;;标记;标记;③DNA聚合酶I对探针序列的标记;5’?3’外切酶活性从DNA缺口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在缺口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。;;2.Klenowfragment;①3’端补平;;③cDNA第二链的合成;（1）T4DNA聚合酶的性质;③特点;;（2）T4DNA聚合酶的用途;;a.放射性标记的优缺点：;b.非放射性标记;纯化的DNA片断;光促生物素标记;抗生物素蛋白（avidin）：;ii）地高辛标记：;;iii）偶联酶及其底物;化学发光底物;HRPO和AP的显色反应底物;发光反应机理;iv）用非放射性标记的探针检测原理;;4.T7DNA聚合酶;（2）T7DNA聚合酶的特点;②进行末端标记;5.修饰后的T7DNA聚合酶;6.逆转录酶;;（3）逆转录酶的用途;;第四节DNA修饰酶;;4.末端转移酶的用途;（2）再生酶切位点;;（3）非放射性标记DNA片断的3’端;二、T4多核苷酸激酶;;3.多核苷酸激酶的用途;;三、碱性磷酸酶;2.碱性磷酸酶的特性;;;;第五节核酸外切酶（Exonucleases）;二、双链DNA外切酶;2.?核酸外切酶（?exo）;3.T7基因6核酸外切酶;;第六节单链DNA内切酶;3.S1核酸内切酶的功能;;4.S1核酸酶的用途;谢谢大家！