高温蛋白酶产生菌的分离和筛选.doc

【标题】?高温蛋白酶产生菌的分离和筛选 【作者】李 刚 【关键词】高温蛋白酶??嗜热菌??筛选 【指导老师】戴 玄 【专业】生物 【正文】1.?引?言1.1选题依据极端微生物是在极端环境中（高温、寒冷、强酸强碱、高盐等）能够正常生存的微生物的统称。极端微生物为适应环境，有一些特殊的代谢产物，或者对特定物质的代谢能力大大超过常规微生物。来自极端微生物的极端酶是生物为适应生存环境并进行繁衍的基础，这些酶在极端环境下有着与普通蛋白酶不同的活力和稳定性。高温蛋白酶产生菌属极端微生物范畴。可分为嗜热型和耐热型。即凡最适生长温度(Topt)在45℃以上，最高生长温度(Tmax)在50℃以上的细菌被称为嗜热细菌(thermophilic bacteria)[18]。嗜热细菌可以在高温下生长繁殖，其细胞结构及所分泌酶可以在高温下保持活性及稳定性，人们可以利用这些酶来研究嗜热性(thermophility)和热稳定性(thermostability)。嗜热细菌产蛋白酶还具有很高的商业应用潜力。高温蛋白酶是蛋白酶品种之一，由于其显著的耐热性及其对有机溶剂、去污剂和变性剂较强的抗性，使其在洗涤、毛皮软化、丝绸脱胶、水解蛋白质、以及医药和食品的增鲜和嫩化等诸多方面具有良好的应用前景。高温蛋白酶的耐热机制的阐明将为提高具有重要商业价值的工业用酶的稳定性提供理论依据。无论是高温蛋白酶的理论研究还是开发其应用功能，重要条件是获得高温蛋白酶，微生物是蛋白酶最重要的来源。微生物来源的蛋白酶大都是胞外酶，较动物、植物来源的蛋白酶易于分离、纯化。因此，首要条件是获得高温蛋白酶的高产菌。一般而言，蛋白酶的热稳定性与产酶菌株的生长温度呈正相关性。因此，为了获得较高热稳定性的高温蛋白酶，就应从嗜热细菌和耐热细菌中筛选产蛋白酶菌株。1.2研究现状自从1945年瑞士人Dr.jaag等发现了微生物碱性蛋白酶[8]、1962年Endo首次从土壤中分离到含Zn离子高温蛋白酶[14]那时起，外国学者就已开始了高温菌产高温蛋白酶的研究，并有许多这方面的报道。国内对高温菌的研究较晚，到八十年代才有复旦大学、中科院北京微生物研究所和云南省微生物研究所三家单位较具规模[2]。随后，我国对高温菌及其蛋白酶产物的研究逐渐增多，1995年章剑林等采用高温超剂量常规诱变筛选方法筛选到耐高温酸性蛋白酶的菌株[11]。1997年戴玄等对产高温蛋白酶微生物菌种资源进行了研究[1]。2001年武波等筛选到一株产耐高温碱性蛋白酶菌株[8]。2004年刘军从堆肥、土壤中筛选到产高温蛋白酶高温菌[2]。迄今为止，已发现好几个属的嗜热细菌产蛋白酶，包括芽孢杆菌属(Bacillus)、高温单孢菌属(Thermomonospera)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nlocardia)及极端嗜热细菌(extreme thermophiles)中的一些属，如栖热菌属(Thermus)等。现在已经有许多由嗜热细菌产生的蛋白酶被分离和鉴定，其中研究得最为详尽的是一种有较高工业价值的，由嗜热脂肪芽孢杆菌的一个菌株——嗜热解朊芽孢杆菌(B.thermoproteolyticus)产生含Zn2+的中性蛋白酶即“嗜热菌蛋白酶”(Thermolysin)[14]。其它研究得比较清楚的嗜热菌产蛋白酶包括嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的中性蛋白酶、变暗高温单孢菌(Thermomonospora fusca? YX)产碱性蛋白酶等。已报道的极端嗜热细菌产蛋白酶比较少，研究得比较详尽的仅有热溶芽孢杆菌(B.caldolyticus)产胞外蛋白酶，及水生栖热菌(Thermus aquaticus)的几个菌株产胞外蛋白酶。关于高温蛋白酶产生菌的分离、鉴定及酶性质研究已有许多相关的报道。产高温蛋白酶微生物菌种资源的研究表明，尽管嗜热细菌适于高温（≥55℃）条件下生长，但它们在地球上分布十分广泛。在高温、中温甚至低温环境中都能分离到嗜热细菌。这些环境中蕴藏着大量的具有重要理论研究和应用价值的宝贵菌种资源。产高温蛋白酶的嗜热细菌是其中的一类，嗜热细菌产蛋白酶在常温下（37℃）活力不高，比如其在37℃时的酶活仅相当于在60℃时酶活的33%[1]，但将其纯化后，在其生理温度下及在生活细胞内，嗜热细菌产蛋白酶的比活力与嗜温菌产蛋白酶比活力相当或更高，Cowan等发现，嗜热菌蛋白酶在以蛋白质低分子肽为底物时，在高温下可表现出非常高的比酶活[13]。例如，水生栖热菌T350产生的胞外蛋白酶Coldolysin的蛋白酶活与酰胺酶活（以酪蛋白casein及benzoyl-L-phe-L-val-L-Arg-p-nitr