植物组织培养实用操作技术.pptVIP

灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。 消毒指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。 显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物。 常用的消毒灭菌方法 常用的消毒灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即： 物理方法如干热、灼烧、湿热、熏蒸、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和无菌水冲洗等措施； 化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 （1）高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法） 适用于培养基、玻璃器皿、棉塞、布制品及金属用具等的灭菌，一般灭菌掌握在0.11—0.12MPa压力，20～30min。 干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具） 熏蒸灭菌（接种室、培养室空间） 利用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。 常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。对有培养材料的培养室，可改用乙二醇加热熏蒸的方法，每m3用乙二醇6mL即可。 药剂表面灭菌（植物材料） 药剂灭菌法适用于培养材料的表面灭菌，药剂灭菌必须根据培养材料的特点，选择适合的药剂种类、浓度和消毒时间。原则上要求既达到灭菌目的，又不能损伤组织和细胞。 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。 灼烧灭菌（用于接种器械及培养器皿瓶口） 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。 其他: 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类； 麦芽提取液(0.01%～0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。 3）母液配制要求： 1.母液浓缩倍数：大量元素10～20；微量元素500~1000；铁盐100；有机物100～200； 2.选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂 3.防止沉淀 4.激素母液浓度：0.1～1mg/ml，1次配成50或100 ml 大量元素：10倍 微量元素：1000倍 铁盐：100倍 有机物：500倍 生长素：0.2mg/ml 细胞分裂素：0.5mg/ml 例1：1/2MS＋NAA0.1 ＋Suc2.0％＋Agar0.8％ 例2：MS＋KT0.1＋BA2＋IAA0.5＋椰乳10% 例3：配制MS0 例4：配制2L以下培养基 MS＋BA1.0＋NAA0.2＋Suc3%＋Agar0.8% 大量元素：20倍;微量元素：500倍;铁盐：100倍 有机物：200倍;NAA：0.2mg/ml;BA：0.1mg/ml 大 100ml，微 4ml，铁 20ml，有10ml BA：20ml NAA：2ml Suc：60g Agar：16g 5）培养基的选择 培养基＝基本培养基 ＋ 植物激素 （物质基础 ） （调控手段） 生存 ←→ 发展 培养基的选择在实质上讲就是设计营养物质与激素（种类、用量）的最佳组合，实现离体细胞的生长、分化与植株再生。而最佳组合的结论作出，需研制培养基配方并试验其效果。 在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，对这种培养基的物质种类、用量、比例关系作出适当调整后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基。选择最佳培养基，常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。 （1）单因子试验 在试验中，培养基中其他成分都维持在一般水平上，只变动一个因子，通过