免疫组织化学实验1.ppt

免疫荧光法实验 直接法 标本 肾穿刺活检标本，冰冻切片，厚5 μm 试剂 荧光标记抗体：兔抗人IgG-FITC 兔抗人IgA-FITC 兔抗人IgM-FITC 兔抗人C3-FITC 工作浓度均为1：30 0.01mol/L pH7.4 PBS 缓冲甘油：1份0.01mol/L pH8.0 磷酸缓冲液 9份甘油混匀 染色步骤 1）肾穿刺活检标本冰冻切片室温下用丙酮固定 10min， 再以PBS洗5min×3次 2）切片于湿盒内分别滴加IgG-FITC、 兔抗人IgA-FITC 兔抗人IgM-FITC 兔抗人C3-FITC 37℃， 30min→以PBS洗5min×3次 3） 用缓冲甘油封片 4 ）荧光显微镜下观察结果，并照相记录 结果 肾小球特异性染色部位呈翠绿色 免疫荧光法实验 间接法 标本 肾穿刺活检标本，冰冻切片，厚5μm 试剂 第一抗体： 羊抗人IgG抗血清，工作浓度为1：40 羊抗人IgM抗血清，工作浓度为1：30 羊抗人IgA抗血清，工作浓度为1：30 兔抗羊IgG-FITC，工作浓度为1：30 0.01mol/L pH7.4 PBS 缓冲甘油：1份0.01mol/L pH8.0 磷酸缓冲液 9份甘油混匀 染色步骤 1）肾穿刺活检标本冰冻切片室温下用丙酮固定 10min，再以PBS洗5min×3次 2）置切片于湿盒内，分别滴加羊抗人IgG抗血清、羊抗人IgA抗血清、羊抗人IgM抗血清，37℃，30min→以PBS洗5min×3次 3）滴加兔抗羊IgG-FITC，37℃，30min→以PBS洗切片5min×3次 4）用缓冲甘油封片 5）荧光显微镜下观察结果，并照相记录 结果 肾小球特异性染色部位呈翠绿色 标本 肝炎组织之石蜡切片，厚4μm 试剂 兔抗HBcAg抗血清，工作浓度1：300，Dako公司产品； 羊抗兔IgG抗血清，工作浓度1：200，实验室自制； 兔PAP试剂，工作浓度1：200，实验室自制； 0.01mol/L pH7.4PBS； 0.3%H2O2－甲醇溶液 临用前配：1ml30%H2O2加甲醇溶液至100ml，混匀 DAB显色液 亲和免疫组化法实验 ABC法检测淋巴瘤组织内白细胞共同抗原（LCA） 试剂: 小鼠抗LCA单克隆抗体，工作浓度1:100 Vector公司产品 正常兔血清，工作浓度1：20(实验室自制) 生物素化兔抗小鼠IgG 0.3%H2O2－甲醇溶液 0.01%胰蛋白酶消化液 DAB显色液 0.01mol/L pH7.4PBS 0.1%甲基绿 染色步骤 1)石蜡切片常规脱蜡后，用自来水洗，在用蒸馏水洗； 2)切片入0.3% H2O2－甲醇溶液，37℃，30min，以消除组织内源性过氧化物酶活性； 3)切片经水洗、蒸馏水洗，入已预热的0.1%胰蛋白酶消化，37℃，30min，去除变性蛋白,暴露抗原； 4)切片经蒸馏水洗，再用PBS洗5min×3； 擦去组织周围PBS， 5)滴加1：20正常兔血清，置切片于湿盒内，37℃，20min； 6)倾去正常兔血清，滴加1：100小鼠抗LCA单克隆抗体，37℃，1h，移至4℃冰箱过夜→切片，以PBS洗5min×3； 7)滴加1：100生物素化兔抗小鼠IgG，37℃。1h→切片以PBS洗5min×3； 8)滴加1：100之ABC试剂，37℃，30－45min→切片以PBS洗5min×3； 90滴加DAB显色液，显色时间为5－10min（显微镜下控制显色程度）； 10)切片经蒸馏水洗，入1%甲基绿复染细胞核。 11)切片脱水、透明、封固、镜下观察。 结果：阳性的细胞膜和胞浆为棕褐色，胞核为淡绿色。 试剂 多聚甲醛－赖氨酸－过碘酸钠（PLP）固定液 0.01mol/L pH7.4PBS。 辣根过氧物酶标记的兔抗羊人纤连蛋白（RAHFnHRP），工作浓度1：20（用含有0.015%皂角素的PBS稀释）； DAB显色液 1%锇酸固定液（含1.5%铁氰化钾）； 二甲砷