普通组织化学.ppt

第四章 普通组织化学 ? 普通组织化学是指以常用的组织化学技术，对细胞内主要化学成分和活性的粗略（一般性）的研究。 本章就几个经典实验概要介绍如下： 一、?????? 核酸（DNA和RNA） （一）?? 化学特性 1．分布： DNA （细胞核内） RNA（核仁10% ；细胞质-核糖体90%） 2． 分子结构：戊糖 + 磷酸 + 碱基 特点：① 大量的磷酸基团→酸性 （嗜碱性的基础） ② 戊糖—被盐酸水解→醛基 （成为Feulgen法显示核酸的基础） ② 戊糖—被盐酸水解→醛基 （成为Feulgen法显示核酸的基础） ③ 可以完全水解或部分水解 ④ 可以用RNAase或DNAase消化 [ 对照实验（—）] ? （一）?? 显示方法 1． 福尔根（Feulgen）反应显示DNA [ 原理 ] 在60℃温度下，将DNA用1N盐酸水解，DNA双链打开成单链，先释出碱基，然后脱氧核糖释出醛基，该醛基与Schiff氏液形成紫红色沉淀。 [ Schiff试剂显色原理 ] 碱性品红 亚硫酸 → 白亚黄酸 （无色试剂，称为Schiff试剂） [方法] 固定剂的选择可用一般的组织学固定液，常 用Carnoy固定液。 Carnoy固定液： 纯酒： 氯仿： 冰醋酸 = 6：3：1 (60ml) (30ml) (10ml) 恒冷箱切片机的具体染色步骤如下： ⑴ 切片固定在冰醋酸与纯乙醇（1：3 V/V） 中10分钟。 ⑵ 由乙醇降至蒸馏水中。 ⑶ 用1N盐酸浸泡。 ⑷ 放入预热到60℃的1N盐酸中，留6分钟。 ⑸ 放入室温的1N盐酸中。 ⑹ 放入Schiff液试剂，保持在暗处，60分钟 ⑺ 用新配制的SO2水浸洗3次（脱掉未反应 的Schiff液）。 ⑻ 蒸馏水浸洗净（必须用蒸馏水→洗净无色品红， 否则，残留试剂→有色品红）。 ⑼ 脱水透明、封固。 结果：核内DNA染为红紫色。 对照：仅改变第4步为1N盐酸，室温15分钟→（-）。 [ 注意事项 ] ⑴ 不用醛类固定剂如Bouin、戊二醛、丙烯醛等。 常用Carnoy液、甲醇等。 ⑵ 控制水解时间，不同的固定剂用不同的时间， 如：Carnoy 8分钟；Genker 5分钟； Susa 18分钟 ★ 最适条件应自行试验。 ⑶ 控制温度，一般1N盐酸60℃； 如果5N盐酸18～25度。 ⑷ 保证Schiff试剂的纯净度。 ⑸ SO2要新配制，除去多余的 Schiff液宜用之。 ⑹ 必须对照。 2．? 显示核酸的其它方法 ⑴ Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法 ⑵ 甲绿派若宁Methy green-Pyronin显示DNA和 RNA法 ⑶ 菊花青铬明矾（GC）显示核酸法 ⑷ 丫啶橙Acridine Orange显示DNA和RNA法 ⑸ 核酸提取法 ?一、?????? 蛋白质（Protein） ? （一）蛋白质的分子结构 蛋白质的基本单位是氨基酸，肽键将不同的氨基酸结合在一起，除氨基和羧基之外，还含有其它基团，如：—羟基、硫氢基、二硫基等。依其结构特点可分为：酸性氨基酸 和碱性氨基酸 ；芳香族氨基酸：苯丙氨基酸、酪氨基酸；杂环类氨基酸：组氨基酸、色氨基酸、亚氨基酸、脯氨基酸、羟脯氨基酸。 ? （二）目前应用 1．? 用于蛋白质的一般定性 ① 确定是否为蛋白质 ② 确定蛋白质的酸碱性 ③ 显示蛋白质的特殊基团 2．? 用于蛋白质功能定性和定位 ?（三）染色方法 目前，研究蛋白质功能定性和定位时多用酶 组织化学法、配体—受体结合法、免疫组化法以 显示特殊的蛋白质。这里仅介绍一般的染色方法。 1．四氮化联邻茴香胺法 （Tetra-azotized-o-anisidine） [ 应用 ] 广泛应用于显示酶的活性 [ 原理 ] 芳香伯胺与亚硝酸作用，在低温下（＜ 5℃）可生成重氮盐，此即重氮反应。重氮盐可 与酚类作用生成有色化合物——偶氮化合物。上 述反应必须在