稻曲菌产色素缺陷性突变的生物学特性-毕业论文.docVIP

本科毕业论文 题 目 稻曲菌产色素缺陷性突变的生物学特性 姓 名 谢 巍 学 号 2008301200176 专 业 植物保护 指导教师 黄俊斌 职 称 教授 中国·武汉 二零一二 年 六 月 分类号 密级 华中农业大学本科毕业论文 稻曲菌产色素缺陷型突变体的生物学特性 The biological characteristics of the rice aspergillosis production of the pigment deficient mutant 学生姓名：谢巍 学生学号：2008301200176 学生专业：植物保护 指导教师：黄俊斌 教授 华中农业大学植物科学技术学院 二○一二年六月 目 录 摘要 I Abstract III 1.前言 2 1.1 稻曲病在我国的背景 2 1.2实验原理 2 2材料与方法 3 2.1材料 3 2.1.1菌株 3 2.1.2培养基和相关试剂 3 2.1.3限制性内切酶及其它酶类、试剂盒 4 2.1.4载体、DNA分子量标记 5 2.1.5抗生素 5 2.1.6引物 6 2.1.7供试水稻品种 6 2.1.8盆钵及接种器规格 6 2.2稻曲菌T-DNA插入体库的构建 6 2.2.2稻曲菌分生孢子培养方法 6 2.2.3农杆菌培养方法 7 2.2.4 ATMT转化方法 7 2.2.5转化子保存方法 7 2.2.6转化子的色素缺陷型筛选 8 2.3稻曲菌S-81的T-DNA侧翼序列克隆及序列分析 8 2.3.1 基因组总DNA的提取 8 2.3.2突变体基因组DNA的酶切产物连接及连接产物的回收 9 2.3.3酶切 9 2.3.4连接 9 2.3.5反向PCR扩增 9 2.3.6 目的片段的回收及连接 11 2.3.7连接产物的转化 11 2.3.8重组质粒的提取及PCR鉴定 11 2.3.9 重组质粒的测序及克隆序列分析 12 2.4转化子的致病力测定 12 2.4.1水稻种植 12 2.4.2接种体的制备 12 2.4.3接种时期和方法 12 2.4.4调查与统计 12 3结果与分析 14 3.1稻曲菌T-DNA插入体库的构建 14 3.2稻曲菌T-DNA插入体库的检测 14 3.3突变体菌株S-81 形态特征、菌丝生长速度及产孢量测定 15 16 3.4侧翼序列全长及相关分析 17 18 3.5突变体菌株S-81的致病性测定 20 4、讨论 22 参 考 文 献 24 致 谢 26 摘要 水稻稻曲病是由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens(Cooke) Tak)引起的一种穗部病害。该病害在世界各水稻种植区均有不同程度的发生，并且在某些年份曾一度大发生。木藏良三(1991)首先报道白色稻曲球的发生，白化菌株稻曲球的表层和内层均为白色。国内王疏（1997）等首先报道发现白色稻曲球，PS培养基中产分孢量极少，厚垣孢子表面光滑，PS滤液对水稻根和芽有毒性，可以使水稻发病产生白色稻曲球，用酯酶同工酶和RAPD分析认为白化菌株具有独立于稻曲病菌新的分类地位。林逾凡（2009）报道白化菌在固体培养基(PSA)、液体培养基(PS)上均不产生任何类型的抱子。白化菌株的接种试验结果显示，突变后的菌株不能使水稻发病。白化菌株的ITS序列和正常菌株的同源性达到100%。说明这种白化菌株属于稻曲病病原菌。本研究利用ATMT遗传转化系统，以质粒pTFCM为转化体，利用潮霉素抗性筛选转化子，对稻曲病菌分生孢子进行了转化。构建了含1500多个的T-DNA插入突变体库。随机挑取10个转化子, 以稻曲菌野生型菌株HWD-2和质粒pTFCM为对照，提取基因组DNA 进行 PCR 检测，质粒pTFCM和10个样品均扩增出潮霉素磷酸转移酶基因片段，野生型稻曲病菌株HWD-2不能扩增到潮霉素磷酸转移酶基因片段。通过潮霉素筛选和PCR检测，可证明 T-DNA 已成功地插入到了稻曲病菌基因组中。 目前已经对1500个转化子的菌落形态差异进行了比较，得到到11株产色素缺陷的白化菌株，分别为B-12，F-18，F-24，F-37，F-56，F-61，F-64，G-6，G-29，J-44和S-81。对产孢量进行测定，白化菌株