生物质谱技术、蛋白质鉴定.pptVIP

第七章 生物质谱技术、蛋白质鉴定 　　质谱法 (mass spectrometry, MS)：是在高真空系统中将样品分子离解成带电的离子，并通过对生成离子的质量和强度的测定，而进行样品成分和结构分析的方法。 　　质谱学 (mass spectroscopy)：研究质谱法及样品在质谱测定中的电离方式、鉴别规律以及质谱图特征的科学称为质谱学。 质谱仪系统方框图 磁质谱仪原理图 四极质谱仪示意图 飞行时间质谱 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪 ESI 离子化示意图 MALDI 离子化示意图 预防酶自解和微生物的污染： ⑴ 使用较好的测序级TPCK-Trysin； ⑵ 在加酶使胶块吸胀后，一定要去掉多余的酶液，不要认为这样会影响酶解效率； ⑶ 酶解时间不宜过长，~24hr； ⑷ 电泳玻板、染胶的器皿等用前要清洗； ⑸ 所用试剂和溶液的纯度要高，以保证质谱分析的可靠性； ⑹ 尽量用干净的乳胶手套和洁净的EP管及Milliq水； ⑺ 尽量减少不必要的操作步骤，简化操作程序； ⑻ 要有一个洁净的操作环境。 胶内酶解注意事项： ⑴ 若样品种类较多，应将离心管编号，样品对号入管； ⑵ 考染方案各注释均适用银染方案； ⑶ 整个操作过程应注意角蛋白等的污染； ⑷ 佩戴一次性乳胶手套，使用洁净的离心管及Millipore水； ⑸ 不同公司的酶需要不同的最适的pH，因此，需调pH值。 样品的纯化与浓缩： ⑴ 操作步骤 ⑵ 配制适当的溶液 ⑶ 对不同质量范围的蛋白质或肽段的提取效率应事先估计 ⑷ 注意事项： 　① 整个操作过程润湿体积0.6μl（因填 料为0.6μl )； 　② pH4； 　③ 整个过程不能引入气泡； 　④ 注意流速，最好速度均匀。 肽在CID中的断裂 三级四极质谱仪 Schematic of a typical experimental setup for a PSD experiment 肽质量指纹图谱 (peptide mass fingerprint, PMF) 　　每个蛋白质经过酶解后成为长短不一的肽段，同一时间获取所有肽段分子质量而形成一个肽段分子质量图谱，这一图谱对蛋白质反应是专一而特异的，因此称为PMF。 * * 基质辅助激光解吸离子化用于生物大分子 1988 Tanaka, Karas et al. 电喷雾离子化用于生物大分子 1984 Yamashita, Fenn et al. 快原子轰击 1981 Barber, Bordoli et al. 傅立叶回旋共振质谱 1974 Comisarow and Marshall 液相质谱 1973 McLafferty 串联质谱 1967 McLafferty, Jennings et al. 肽序列分析 1959 Biemann, Seibl et al. 气相质谱 1956 Gohlke and McLafferty 第一台质谱仪 1912 J. J Thomson 贡献 时间 研究者 质谱技术发展历史简介 质谱图 四极离子阱质谱 流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘； 气帘的作用：雾化、蒸发溶剂、阻止中性溶剂分子。 Rayleigh Limit Reached + + + + + + + + + + - - - - - + + + + + + + + + + - - - - - + + + + + + - - + + + + + + - - Evaporation + + Charged Droplets 试样离子 准分子离子 Analyte Ions Solvent Ion Clusters Salts/Ion pairs Neutrals + + + + + + + + - - 其他离子 注：+ 表示性能强大程度。 + ++++ + +++ ++++ 基质辅助激光解吸离子化-离子阱质谱 (MALDI-IT-MS) +++ +++ +++ +++ ++ 基质辅助激光解吸离子化-三级四极杆-飞行时间质谱 (MALDI-Q-TOF-MS) ++ ++++ ++ +++ ++ 基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱 (MALDI-TOF/TOF-MS) ++ ++++ ++ ++++ + 基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) ++++ ++++ ++++ + ++++ 电喷雾-傅立叶回旋共振质谱 (ESI-FTICR) +++ +++ +++ + ++ 电喷雾-三级四极杆-飞行时间 质谱 (ESI-Q-TOF-MS) ++ +