医学分子生物学(PCR).pptVIP

课程主要内容 第二部分 分子生物学常用技术 核酸 (DNA, RNA) 碱基互补配对A=T, C≡G, A=U 核酸变性与复性 核酸合成 DNA复制（DNA－DNA）， 逆 转 录（RNA－DNA）； 转 录（DNA－RNA）， RNA复制（RNA－RNA）； DNA聚合酶——DNA生物合成 如何获得单链DNA模板？？ 多种蛋白质参与（以大肠杆菌为例） DNA复制中为何需RNA引物？ DNA聚合酶没有从头催化2个游离的脱氧核苷三磷酸聚合的能力； 只能在3’-OH端与按碱基配对的dNTP进行反应，生成磷酸二酯键； 引物提供游离的3’-OH末端； 一、聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR) PCR－酶促DNA合成 PCR的主要用途 （一）目的基因的克隆，序列分析 （二）基因的体外突变，多态性研究 （三）DNA的微量分析 PCR扩增条件 94℃, 300S （预变性） 94℃, 30S（变性） 25 ～40cycles 55~65℃, 30S 72℃, 30~120S （退火，与引物有关） 72℃, 10min 引物设计步骤： 获取包含待扩增DNA的核酸序列； 引物设计软件选择合适引物； 设计的引物序列的特异性分析； 核酸序列数据库 1、美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）：网址：/。 2、欧洲生物信息学研究所（European Bioinformatics Institute, EBI），以及所维护的EMBL数据库（http://www.ebi.ac.uk/embl）。 3、日本国立遗传学研究所（Japan National Institute of genetics center for information biology）的DDBJ数据库（DNA Data Bank of Japan）(http://www.ddbj.nig.ac.jp)。 NCBI网页的BLAST界面（序列比对） NCBI网页的BLAST2 SEQUENCES界面 PCR产物的鉴定（一） －凝胶电泳 ? 琼脂糖凝胶 ———用于分离100－10000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 ? 聚丙烯酰胺凝胶 ———用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围 核酸序列分析（nucleic acid sequence analysis)技术是用人工的方法测定并分析核酸的碱基组成及排列顺序，即核酸一级结构的测定。 这是分子生物学三大基本技术之一，测定并分析核酸的序列，是研究其结构、功能及其相互关系的前提，是分子生物学最基本的课题。 临床基因扩增检验实验室管理 分三/四区： ? 试剂储存和准备区 ? 标本制备区 ? 扩增区 / 扩增产物分析区 区域明确标记，物品避免混用； 单一方向进入； 区域专用工作服，避免混用； 室内质量控制，室间质量评价 PCR假阴性的产生 ? 硬件：仪器 离心机、PCR仪 离心机：离心效率 PCR 仪：孔间差异 PCR技术中的困难 模板：DNA－－－RNA？？mRNA与表达 定量的问题？？ 半定量的不准确性 未知序列问题