浅析基因工程中工具酶的几个问题.pdfVIP

22 生 物 学 通 报 2011年 第 46卷 第7期 浅析基因工程 中工具酶的几个 问题 章 青 (江苏省苏卅实【验中学 江苏苏州 215011) 摘要 就~rt-*4酶与 DNA连接酶在实际应用 中常出现 的问题加 以分析 ，主要是分子 内自身 环化产生的原 因及解决的方法，通过这种背景材料的分析可以培养学生提高思维能力。 关键词 工具酶 环化 改造 中国图书分类号 ：Q783 文献标识码 ：E 基 因工程 的内容在近几年的高考 中出现频率 的碱基序列相 同并且切 点也相 同，因此产生 的末 很高 ，难度也 比较大 ，尤其是操作过程 中相关酶 的 端相同，这些末端 的结合与 同种酶切 的结果相 同。 问题 ．主要是 限制酶与 DNA连接酶在实际操作 中 AgeI (A／CCGGT) AvaI(C／CCGGG) 的应用技巧 。下面就新课标选修 3“现代生物科技 专题 ”与基因工程中工具酶相关 的问题加 以分析 一GjL’ -G∞Jj，C一 说 明，供大家参考 。 1 基因操作需要的工具酶只有 2种吗 一 TGq ／-G_ 基 因操作 的工具酶除了限制酶和 DNA连接 ＼ ／ 酶外 ，还需要 DNA聚合酶 、逆转录酶 、末端核苷酸 转移酶 、RNA聚合酶 、修饰酶 、磷酸酯酶和核酸外 切酶等参与基 因工程 中涉及到一系列反应 的酶 。 如用 PcRir扩增 目的基 因时 ，就需要应用 DNA聚 2．3 同尾酶切 一类识别 DNA分子 中不 同核苷 合酶 ，用逆转录 的方法构建 cDNA文库时就需要 酸序列 ，但能酶切产生相 同黏性末端 的限制性 内 应用逆转录酶 ，在对平末端加尾 时就需要应用末 切酶 。这一类 的酶来源各异 。识别的靶也不相同， 端核苷酸转移酶 。 但产生相 同的粘性末端 。由同尾酶产生 的片段 ，是 2 DNA分子片段出现 自身环化的原 因是什 么 能够通过其粘性末端之 间的互补作用彼此连接起 2．1 同一种 限制酶切 在 中学生物学教材 中关 来 的。当把 同尾酶切割 的DNA片段与原来的限制 于 目的基因和运载体 (如质粒)结合的内容中，强 性 内切酶切割 的DNA片段连接后 ，2条链上 的碱 调用 同一种 限制酶切割外源基 因和质粒 ，这样形 基序列发生 了变化 ，原来 的酶切位点将不存在 ，不 成相 同的黏性末端 ，便于连接 。当然这样处理有利 能被原来 的限制性 内切 酶所识别 。如 AgeI(A／ 于学生理解 目的基因与质粒的结合 。但在 实际操 CCGGT)和 AvaI(C／CCGGG)识别 的序列与切点如 作 中，如果用 同一种限制酶处理外源基因和质粒 ， 图 1所 示 ，新形成 的 DNA片段 则不能被 AgeI或 由于质粒的切 口处的末端相 同，并且 目的基 因两 AvaI切割 ．但 由于 2条链上 的黏性末端组成 的4 端 的切V1也相 同。很容易 自身环化 。也可能不 同分 个碱基对组成 的回文结构 ，因此 ，通常可 以用 4碱 子间进行任意 串联 ，当然有一部分形成重组质粒 。 基 限制酶重新切割 ，如 HpaII(C／CGG)切割 。 这样得到重组质粒的概率就 比较低 。 2．4 平末端连接 不 同的限制酶切割 的末端可 2．2 同裂酶切 由不 同微生物分离得到 的限制 以由TaDNA连接酶来修复磷酸二酯键 ，由于平末 酶 ，但能识别相同DNA