晚期糖基化终末产物对人脐静脉内皮细胞分泌NO 功能的影响.docVIP

天津医药 2013 年 6 月第 41 卷第 6 期 doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2013.06.025 晚期糖基化终末产物对人脐静脉内皮细胞 分泌 NO 功能的影响*  597 张胜雷 徐金升Δ 王悦芬 白亚玲 崔立文 张慧然  【摘要】 目的 法 AGEs-HSA 组，分别用不同质量浓度的 AGEs-HSA、HSA 刺激细胞 24 h。然后用酶联免疫法分别测定细胞培养上清 液中的 NO 水平、一氧化氮合酶（NOS）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平。结果 与 HSA 组相 比，AGEs-HSA 组在质量浓度为 100、200、400 mg/L 时能够明显抑制 NO 的产生和 NOS 的活性，并呈浓度依赖性（P 0.05）。与 HSA 组相比，AGEs-HSA 组在质量浓度为 25、50、100、200、400 mg/L 时均能够明显抑制 SOD 活性和促进 MDA 水平增高，并呈浓度依赖性（P 0.05）。AGEs-HSA 组在 400 mg/L 时，NO 水平和 NOS 活性、SOD 活性呈正相关（r 分别为 0.93、0.92），与 MDA 水平呈负相关（r=-0.83），NOS 的活性与 SOD 活性呈正相关（r=0.90），与 MDA 水平呈负相 关（r=0.87）。结论 AGEs 能抑制人脐静脉内皮细胞 NO 的分泌，其机制之一可能是介导内皮细胞发生氧化损伤致使 NOS 活性降低进而导致内皮细胞合成 NO 减少。 【关键词】 糖基化终产物, 高级；内皮细胞；脐静脉；一氧化氮；一氧化氮合酶；超氧化物歧化酶；丙二醛  晚期糖基化终末产物（AGEs）是由人体内还原糖的醛基 组与蛋白质的氨基组发生非酶性糖化氧化反应所形成的混 合物[1]。研究证明，AGEs 通过直接修饰蛋白质、脂质、核酸等 以及与 AGEs 受体结合的方式直接或间接导致心血管疾病的 [2] 病的重要病理生理基础[3]。血管内皮细胞合成和分泌的一氧 化氮（NO）是调节血管舒缩功能的重要组成成员，是作用最 强的舒血管物质之一，其水平变化直接影响心血管的舒缩功 能，在心血管疾病中起非常重要的作用。然而，AGEs 对血管 内皮细胞分泌 NO 的功能是否具有损伤作用目前还不完全清 楚。本研究以人脐静脉内皮细胞为对象，探讨不同质量浓度 人血白蛋白（HSA）、AGEs 修饰的人血清白蛋白(AGE-HSA) 对内皮细胞分泌 NO 功能的影响。 1 材料与方法 1.1 细胞株 人脐静脉内皮细胞株购于上海中国科学院细 胞库。 1.2 主要仪器 作 台（美 国 BIOLOGICAL 公 司），LH50A 型 倒 置 相 差 显 微 镜 （日本 OLYMPUS），HT2 型酶标仪（奥地利 Anthos 公司）。 1.3 主要试剂 培 养 基（美 国 GIBCO 公 司），胰 蛋 白 酶（美 国 Sigma 公 司）， NO、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛 （MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。 1.4 体外制备 AGEs-HSA 按糖孵育法进行孵育 [4]。以 1.75 g/L 的人 HSA 在 含 100 mmol/L 的 D-葡萄糖、200 mg/L 的青霉素、70 μg/L 庆大  霉 素 和 1.5 mmol/L 吩 嗪 硫 酸 二 甲 酯（PMS）的 磷 酸 缓 冲 液 （100 mmol/L）中，于 37 孵育 8 周。以相同条件但不含葡萄 糖的缓冲液孵育的 HSA 作为对照。孵育结束后以无菌的磷 酸 盐 缓 冲 液（pH7.4）透 析 除 去 未 结 合 的 葡 萄 糖 ，用 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌。 1.5 分组方法 将体外培养人脐静脉内皮细胞系随机分为 AGEs-HSA 组和 HSA 组，分别用 25、50、100、200、400 mg/L 的 AGEs-HSA、HSA 与细胞共孵育 24 h，后留取细胞培养上清 液，于-20 保存。然后用试剂盒分别测定细胞培养上清液 中 NO、MDA 水平及 NOS、SOD 的活性，实验重复 3 次。 1.6 统计学方法 量资料以均数±标准差(x±s)表示，符合正态、独立、方差齐的 多个均数间比较采用单因素方差分析，多重比较采用 LSD-t 检验，两变量间相关分析采用 Pearson 直线相关，检验水准α= 0.05。 2 结果 2.1 响 400 mg/L 时能够明显抑制内皮细胞 NO 的产生和 NOS 的活性 （P 0.05），并随浓度增加其生作用逐渐增加，至 400 mg/L 时 达最大，25、50 mg/L AGEs