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PCR方法快速检测HBV 指导教师:于红 张文卿 学 生:刘晓林 王远贺 王瑞静 一、实验背景知识 1、HBV与乙型肝炎 【HBV结构】 【HBV致病性】 HBV传播乙型肝炎的四种传播途径为: 1、血液、血制品等医源性传播 2、母婴传播 3、生活密切接触传播 4、性传播 HBV与肝硬化、原发性肝癌关密切！ 【血清HBV DNA检测】 血清HBV DNA是HBV感染、复制、血液有传染性的直接标志。 实验者综合PCR实验的优缺点，实验条件，选择应用PCR检测HBV。 二、实验原理 【PCR反应成分】 1.模板DNA； 2.引物； 3.四种脱氧核糖核苷酸 4.DNA聚合酶； 5.反应缓冲液、Mg2+等。 三、实验准备 【实验材料】： 引物：5`—TGACAAGAATCCTCACAATA—3` 5`—AGCCCTACGAACCACTGAAC—3`(扩增HBV的S基因，产物长度493bp) Pure ddH2O 10xbuffer 10xdNTP 25mM MgCl2 TaqDNA聚合酶 溴酚蓝 溴化乙锭 TBE缓冲液 琼脂糖 阳性标本一例 待测标本两例 阴性标本一例 【实验仪器】： PCR扩赠仪 水平式电泳槽 紫外透射仪 凝胶成像分析仪 微量加样器等 四、实验步骤 1、取一支Eppendorf管，按如下顺序和计量，依次加入。 Pure ddH2O 112.2ml 10xbuffer 18ml 10xdNTP 18ml 25mM MgCl2 10.8ml primer1 3.6ml primer2 3.6ml Taq DNA聚合酶 1.8ml 5、依次从五个Eppendorf管中取出扩增后的液体，以5：1的比例与溴酚蓝混合，依次加入凝胶孔中。 另一孔中加入Mark 6、近凝胶孔侧接“—”极，对侧接“+”极，电压80V,电泳30分钟. 7、取出凝胶,在紫外灯下观察结果. 五、实验结果 从右到左结果如下 【结果分析】 8、9号标本为阳性标本。 （结果解释：重复加入9号标本、阴性对照标本，是由于在向凝胶孔中加入样品时，防止滴加量少而不出结果。） 六、实验总结 【实验内容总结】 1、PCR的灵敏度极高，在操作中应尽量避免。尤其实在向Eppendorf管加试剂时，更应格外小心，防止污染。 2、当向每支Eppendorf管中加的试剂量十分少时，为避免误差，可各管中相同的材料加在一起，在等份分开。 3、溴乙锭有毒，应戴手套，实验中注意保护自己。 4、由于是第一次的独立实验，实验中对许多先进的仪器不了解，如紫外投射仪、凝胶成像分析仪，给实验结果的记录带来了麻烦。 感谢指导老师张老师、于老师，感谢辛苦的技术室老师！ 谢谢 【乙肝现状】 乙肝广泛流行于全世界，迄今为止，尚未发现无HBsAg阳性携带者地区。全世界60亿人口中有3.5亿人为HBsAg携带者，其中78%分布在亚太地区。我国HBsAg携带人口在1.2亿，占全世界HBsAg携带人口的1/3。根据我国肝炎调查结果，估计我国乙肝病人约有2700万人，每年新发病人约有900 万。 乙肝已经成为全世界的健康杀手！ 2、PCR 【PCR概念】 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体