Exendin-4 的固相化学合成及鉴定.pdfVIP

1 中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，３１（２）：６９７３ ? Ｅｘｅｎｄｉｎ４的固相化学合成及鉴定 刘延杰　季　虹　林鲁霞　臧学章　宋长征　荣海钦 （山东省内分泌与代谢病研究所山东省医学科学院　济南　２５００６２） 摘要　Ｅｘｅｎｄｉｎ４是首个获准上市的肠促胰素类似物药物，可模拟人体自身激素ＧＬＰ１的功能，不 仅改善血糖，还能促进胰岛 细胞新生、增殖，抑制 细胞凋亡，改善 细胞功能，促进胰岛素分 β β β 泌，增加机体对胰岛素的敏感性。根据Ｅｘｅｎｄｉｎ４的潜在市场价值，以Ｆｍｏｃ固相合成策略为基 础，ＮＭＰ为反应溶剂，以ＨＯＢｔ／ＤＩＣ为缩合剂，添加盖帽程序，优化合成工艺条件。肽树脂裂解采 用ＴＦＡ／Ｐｈｅｎｏｌ／ＴＩＳ裂解液，并应用高效液相色谱和四级杆飞行时间串联质谱对其进行分析鉴定 和纯化，最终获得Ｅｘｅｎｄｉｎ４，产率为２１％，纯度为９９．４％。活性测定结果显示，合成的Ｅｘｅｎｄｉｎ４ 显著提高胰岛瘤细胞的活性，并呈一定剂量依赖性。 关键词　Ｅｘｅｎｄｉｎ４　固相化学合成　２型糖尿病 中图分类号　Ｑ８１９ 　　Ｅｘｅｎｄｉｎ４是从分布于美国西南部和墨西哥北部地 下一步临床应用提供基础。 区的钝尾毒蜥唾液中分离得到的多肽，由３９个氨基酸 １　材料与方法 组成，与人体内调节血糖浓度的因子胰岛血糖素样肽１ （ＧＬＰ１）有５３％的同源性，二者在体内发挥相同的生 １．１　仪器与试剂 理功能，但 ＧＬＰ１在体内半衰期短，而 Ｅｘｅｎｄｉｎ４则不 　　ＰＳＩ多肽合成仪（ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒＩｎｓ．，美国）， 宜被降解，能更好地发挥降血糖和改善胰岛功能的作 Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱（Ａｇｉｌｅｎｔ，美国），Ａｇｉｌｅｎｔ 用［１］，因此越来越成为治疗糖尿病的研究热点。 ６５２０四极杆飞行时间串联质谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ，美国），冷 　　根据Ｅｘｅｎｄｉｎ４的潜在市场价值，本实验室对长肽 冻干燥仪（ＬＡＢＣＯＮＣＯ，美国）。氨基酸及ＲｉｎｋＡｍｉｄｅ 合成方法进行探索，以多肽固相合成方法为基础，采用 ＭＢＨＡ树脂购自吉尔生化（上海）有限公司，Ｎ甲基吡 Ｆｍｏｃ（９芴甲氧羰基）合成策略，以Ｆｍｏｃ基团保护 氨 α 啶烷酮（Ｎｍｅｔｈｙｌ２ｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ，ＮＭＰ），１羟基苯并三唑 基，叔丁基保护侧链，先将第一个氨基酸的羧基连接到 （１ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，ＨｏＢＴ）、Ｎ，Ｎ二异丙基碳二亚 不溶性树脂上，随后将 Ｆｍｏｃ基团用六氢吡啶脱去，露 胺（Ｎ，Ｎ’ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ＤＩＣ），六氢吡啶 出氨基端，将第二个预先活化的Ｆｍｏｃ保护氨基酸与第 （ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ，ＰＩＰ），１乙酰咪唑（１ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ＡＩＭ）， 一个氨基酸进行缩合反应，然后用溶剂 Ｎ甲基吡啶烷 三氟乙酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｔｉｃａｃｉｄ，ＴＦＡ）、苯酚、三异丙基硅烷 酮洗脱掉未合成的氨基酸，照此方法按多肽序列依次 （ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ，ＴＩＳ），甲基叔丁基醚（ｍｅｔｈｙｌｔｅｒｔｂｕｔｙｌ 将氨基酸连接到树脂上，最后三氟乙酸脱除叔丁基的