毕赤酵母发酵生产T4 溶菌酶的中试研究#39;.pdfVIP

1 中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（１２）：４９５２ ? 毕赤酵母发酵生产Ｔ４溶菌酶的中试研究 １ １ １ １ １ １ ２ １ １ １ 吴家鑫 　余志强 　王华丽 　葛辛玫 　齐　鹏 　郑应华 　刘德虎 　宋　敏 　张国栋 　曹　芹 （１中牧实业股份有限公司兽药研究所　北京　１０００９１　２中国农业科学院生物技术研究所　北京　１０００８１） 摘要　研究了Ｔ４溶菌酶的中试发酵放大生产。在２００Ｌ发酵罐中毕赤酵母诱导表达Ｔ４溶菌酶 蛋白，发酵液蛋白表达量达到１．６９ｇ／Ｌ，酶活达到１９２Ｕ／ｍｇ；制得冻干酶粉２１１．１ｇ。经测定粗酶粉 中Ｔ４溶菌酶的含量达到６８．９％，酶活为１８２Ｕ／ｍｇ，总收率达到６６％，成功建立了一条Ｔ４溶菌酶 的中试发酵生产工艺线路。 关键词　Ｔ４溶菌酶　中试　毕赤酵母 中图分类号　Ｑ８１９ 　　溶菌酶又称细胞壁溶解酶，是一种专门作用于细 １　材料与方法 胞壁的水解酶，由 Ｆｌｅｍｉｎｇ在 １９２２年首次发现。溶菌 酶大体可分为三种类型：ｃ型（鸡蛋清溶菌酶）、ｇ型（鹅 １．１　材　料 蛋青溶菌酶）和噬菌体溶菌酶，它们在底物种类和杀菌 １．１．１　生产菌种　毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ），菌株名 活性方面存在着比较大的差异。迄今为止生产上常用 称为ｐＧＡＰＴ４ＭＰ，由中国农业科学院生物技术研究所 ? ? 的溶菌酶多是从鸡蛋清中提取制备的。噬菌体溶菌酶 提供。 则是由各种能够感染细菌细胞的噬菌体自身所编码 １．１．２　试剂　溶菌酶检测试剂盒，南京建成生物工程 的，通常位于噬菌体的蛋白衣壳内，在感染宿主细胞的 研究所生产；其他试剂由国药集团化学试剂有限公司 过程中起到溶解细菌细胞壁的作用［１］。 提供。 　　Ｔ４溶菌酶是由Ｔ４噬菌体在感染大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ １．１．３　培养基　摇瓶种子培养基：种子培养基组成为 ［２４］ 时所产生的 ? ，它是迄今为止人们发现的杀菌活性最 １％酵母提取物，２％ 蛋白胨，２％ 葡萄糖，加水至 １Ｌ， 高的一种溶菌酶，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均 １１６℃灭菌２５ｍｉｎ。发酵培养基：基础发酵培养基组成 有效果［５］ ［６］ 为２．６７％磷酸，０．０９３％硫酸钙，１．８２％硫酸钾，１．４９％ ，甚至对某些病毒也有效果 。１９８３年Ｏｗｅｎ 等［７］首次克隆出Ｔ４溶菌酶基因并测定了它的核苷酸 硫酸镁，０．４１３％氢氧化钾，４％甘油。在每升基础发酵 序列。 培养基中加入４．３７ｍｌ微量盐溶液 ＰＴＭ１（０．６％硫酸 　　基因工程的最新进展使利用一些酵母细胞作为生 铜，０．００８％碘化钠，０．３％硫酸锰，０．０２％钼酸钠， 物反应器高效表达外源基因成为可能，尤其是巴斯德 ０．００２％硼酸，０．０５％氯化钴，２％氯化锌，６．５％硫酸亚 毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）表达系统。至今，认为利用此 铁，０．０２５％生物素，０．５％硫酸）及０．１‰的消泡剂。高 表达系统已成功表达的外源蛋白超过３００种［８］。Ｈａｏ 压灭菌：在接种前先加入２８％的氨水使该培养基的ｐＨ 等［９］已成功利用毕赤酵母诱导表达了Ｔ４溶菌酶蛋白。 值维持在５．８左右。 本文以中国农业科学院生物技术研究所提供的毕赤酵 １．２　方　法 母菌株完成了 Ｔ４溶菌酶的２００Ｌ发酵罐的中试生产， １．２．１　培养条件　（１）种子培养　 一级种子培养：